常山中抗炎萜类化合物的快速分离

1. 引言

疟疾是一种严重威胁全球健康的寄生虫病，其病程进展常以过度的炎症反应为特征，特别是通过激活 NF-κB 信号通路，导致免疫病理损伤并加重病情 [1]。因此，诱导快速且受到良好调控的抗炎反应，对宿主存活至关重要。虽然控制疟原虫复制需要强烈的初始炎症反应，但必须及时由调节性细胞因子加以平衡，以防宿主组织损伤。这凸显了抗炎机制在防止疾病恶化、同时又不损害寄生虫清除方面的关键作用 [2]。因此，寻找能够同时调控炎症反应的治疗策略，在抗疟治疗中具有重要的临床意义。

中药常山（Dichroa febrifuga Lour.，虎耳草科常山属）用于治疗发热性疾病、尤其是疟疾，有着悠久的历史 [3–5]。现代药理学研究表明，常山富含生物碱与萜类等活性成分，其中常山碱（febrifugine）及其衍生物已被证实具有强效抗疟活性 [6,7]；然而其临床应用受到胃肠道毒性的限制 [8]。近年来，研究者开始关注常山中其他成分的潜在药用价值，特别是萜类化合物 [9]。萜类是广泛分布于药用植物中、结构高度多样的一类天然产物，已被证实具有抗炎、抗氧化和免疫调节等多种生物活性 [10]。其中，某些萜类通过直接靶向核心炎症转录因子 NF-κB、抑制其活化及下游炎症细胞因子的释放而发挥抗炎作用。然而，针对常山萜类成分抗炎活性及其作用机制的系统研究仍然有限，而且传统的分离方法效率低下，制约了其活性成分的快速发现与药理评价。

随着现代分离技术的发展，结构导向的快速分离策略为天然产物研究提供了高效途径。与分子对接、网络药理学等计算分析方法相结合，这些策略能够在分离纯化过程中预测化合物的潜在靶点与通路，从而加速活性成分的发现与机制阐释。本研究旨在：建立常山萜类成分的快速分离方法；系统评价其抗炎活性；通过分子对接验证活性化合物与 NF-κB 的结合能力；并借助网络药理学分析阐明其"多靶点—多通路"协同机制。本研究将为常山传统抗疟用途提供现代药理学诠释，并为抗炎药物的开发奠定基础。

2. 实验部分

2.1 通用实验方法

详见支撑材料（Supporting Information）。

2.2 植物材料

常山（Dichroa febrifuga Lour.，虎耳草科）的干燥根，于 2022 年 6 月采自中国贵州省独山县（东经 107.54°，北纬 25.84°）。

2.3 分离流程

详见支撑材料。

2.4 量子化学计算

详见支撑材料。

2.5 化合物详细数据

化合物 1：白色结晶；[α]20D +327.78（c 0.02, CH3OH）；UV（CH3OH）λmax（log ε）：236（3.47）nm；ECD（CH3OH）（Δε）202（+0.37）、238（−0.52）、256（+0.61）、276（−1.26）、378（+1.43）nm；HRESIMS 给出 [M + Na]+ m/z 493.32755（C30H46O4Na 计算值 493.32883）。1H 与 13C NMR 数据见表 S1、S2。

化合物 4：白色粉末；[α]20D −588.89（c 0.02, CH3OH）；UV（CH3OH）λmax（log ε）：281（2.52）nm；ECD（CH3OH）（Δε）226（+0.67）、386（−0.18）nm；[M + H]+ m/z 333.2441（C21H33O3 计算值 333.2424）。1H 与 13C NMR 数据见表 S1、S2。

化合物 5：黄色粉末；[α]20D −488.89（c 0.02, CH3OH）；UV（CH3OH）λmax（log ε）：288（3.37）、204（3.55）nm；ECD（CH3OH）（Δε）236（+2.13）、392（+0.08）nm；[M + Na]+ m/z 341.20905（C20H30O3Na 计算值 341.20872）。1H 与 13C NMR 数据见表 S1、S2。

化合物 7：黄色粉末；[α]20D −505.56（c 0.02, CH3OH）；UV（CH3OH）λmax（log ε）：283（2.48）nm；ECD（CH3OH）（Δε）226（+0.90）、380（−0.01）nm；[M + Na]+ m/z 350.17212（C20H25O3NNa 计算值 350.17266）。1H 与 13C NMR 数据见表 S1、S2。

2.6 MTT 法测定细胞存活率

详见支撑材料。

2.7 Griess 法测定 NO

详见支撑材料。

2.8 网络药理学

采用 TargetNet（http://targetnet.scbdd.com/home/index/）[11] 预测从常山中分离所得化合物的作用靶点；通过 GeneCards（https://www.genecards.org/）[12] 检索与"inflammation（炎症）"相关的靶点。随后将交集靶点提交至生物信息学平台（https://www.bioinformatics.com.cn/）[13] 进行富集分析。

3. 结果与讨论

3.1 基于 LC-MS/MS 的导向分离

本研究利用基于 LC-MS/MS 的 GNPS 分子网络技术实现天然产物的快速分离 [14]。对组分 Fr·B2、B3 和 B5 进行 LC-MS/MS 数据采集，经 MZmine2 处理后，通过 WinSCP 上传至 GNPS 平台（任务 ID = ec895c100b06431f86305f4c58a27c5d），结果使用 Cytoscape 进行可视化。在 GNPS 网络中，与已知萜类节点处于同一分子家族（molecular family）的未知节点被优先列为分离目标，且其 m/z 值落在 250–500 区间——该范围覆盖了本提取物中绝大多数萜类化合物的质量分布。在这些候选节点中，优先选择总离子流（TIC）丰度较高者，以保证后续分析有足够的样品得量。最后，综合评估色谱保留行为、峰形及样品总量等实际因素，确认分离的可行性。分子网络分析揭示了对应于不同结构类型的明显聚类。其中，有三个节点被鉴定为萜类，分子量分别为 271.200、286.309 和 314.341，提示萜类是其中主要的化学成分类别。在该分子网络策略的导向下，最终从相应分子节点成功分离得到 9 个化合物：化合物 1 来自 m/z 471.145 的节点，化合物 2 和 3 来自 m/z 454.182 的节点，化合物 5 来自 m/z 318.250 的节点，化合物 6 来自 m/z 316.299 的节点，化合物 9 来自 m/z 303.158 的节点。这些结果表明，基于 LC-MS/MS 的分子网络是天然产物靶向分离的有效策略。

3.2 结构解析

化合物 1（新骨架）

化合物 1 为白色针状结晶。HRESIMS 给出钠加合离子 [M + Na]+ m/z 493.32755（C30H46O4Na 计算值 493.32883），据此确定分子式为 C30H46O4。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）：高场区给出 8 个甲基质子信号 δH 0.86（3H, s, H-18）、0.97（3H, s, H-19）、1.18（3H, s, H-21）、1.04（6H, overlap, H-26, 27）、0.87（3H, s, H-28）、0.70（3H, s, H-29）、0.51（3H, s, H-30）；低场区给出 3 个烯氢信号 δH 5.28（1H, m, H-11）、7.31（1H, d, J = 15.5 Hz, H-22）、6.93（1H, d, J = 15.5 Hz, H-23）。H-22 与 H-23 之间偶合常数为 15.5 Hz，表明该双键为反式（E）构型。13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）：给出 30 个碳信号，含 8 个甲基碳（δC 28.2、16.1、21.6、17.2、17.6、23.8、17.7、18.0）、2 个羰基碳（δC 203.9、204.0）和 2 个连氧碳（δC 76.5、70.8）。综合 1H–1H COSY 相关（H1–H2–H3、H5–H6–H7–H8、H11–H12、H15–H16、H22–H23、H25–H26–H27）与 HMBC 相关（H-29 与 C-3/C-4/C-5、H-2 与 C-4、H-19 与 C-1/C-9、H-8 与 C-11/C-13、H-30 与 C-13、H-18 与 C-14、H-16 与 C-20、H-21 与 C-16、H-23 与 C-20、H-22/H-26/H-27 与 C-24），确定了化合物 1 的平面结构。由于 H-18 与 H-28 的信号差异不显著，化合物 1 的准确平面结构仍需借助其他方法进一步验证。计算机辅助结构解析（CASE）是确定平面结构的常用技术，在天然产物结构分析中应用广泛 [15]。CASE 依托庞大的数据库与稳健的算法生成所有可能的结构，再通过算法排序选出最优结构 [16–18]。因此，本研究采用 ACD/Structure Elucidator Suite 软件进行结构解析，并辅以 CASE 技术进一步验证化合物 1 的平面结构。相对构型通过 NOESY 谱分析确定：NOESY 谱中可观察到 H-3/H-5 与 H-28、H-5/H-30 与 H-7 的相关，提示 H-3、H-5、H-7、H-28 和 H-30 为 α 构型；反之，H-3/H-5 与 H-19 之间无相关，而可观察到 H-29 与 H-8、H-8 与 H-19 的相关，表明 H-8、H-19、H-29 为 β 构型。此外，H-8 与 H-18 相关、H-18 又与 H-19/H-21 相关，提示 H-8、H-18、H-21 亦为 β 构型。据此确定相对构型为 3S*, 5R*, 7S*, 8S*, 10S*, 13S*, 14S*, 17R*。该化合物在乙腈中成功培养出单晶，采用 Bruker D8 VENTURE PHOTON II 衍射仪（Cu Kα 辐射）进行单晶 X 射线衍射分析，Flack 参数为 0.07（CCDC：2540649），确定其绝对构型为 3S, 5R, 7S, 8S, 10S, 13S, 14S, 17R。综上，化合物 1 具有一个罕见的碳骨架，其独特结构特征在于：羊毛甾醇型三萜骨架的 C-21 由 C-20 迁移至 C-17。生源途径讨论：萜类由多个异戊二烯单元生物合成而来，主要包括异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。这些前体经牻牛儿基焦磷酸合酶（GPPS）、法尼基焦磷酸合酶（FPPS）、角鲨烯合酶（SQS）和角鲨烯环氧酶（SQE）催化转化，最终生成 2,3(S)-环氧角鲨烯。三萜的结构多样化由不同的氧化角鲨烯环化酶（OSCs）介导，其催化 2,3(S)-环氧角鲨烯环化形成特征性碳骨架 [19–21]。具体而言，OSC_A–H 催化 2,3(S)-环氧角鲨烯生成不同的三萜骨架：环阿屯醇（OSC_A）、羊毛甾醇（OSC_B）、葫芦二烯醇（OSC_C）、达玛烷二醇（OSC_D）、baruol（OSC_E）、羽扇豆醇（OSC_F）、α-香树脂醇（OSC_G）和 β-香树脂醇（OSC_H）[22]。羊毛甾醇来源的三萜随后经酸催化水合与甲基迁移，生成化合物 1。

化合物 4（新化合物）

化合物 4 为白色粉末，HRESIMS（m/z 333.2441 [M + H]+，C21H33O3 计算值 333.2424）确定分子式为 C21H32O3，不饱和度为 6。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）：一组苯环质子信号 δH 6.74（2H, overlap, H-11, 14）；4 组甲基质子信号 δH 1.11（3H, d, J = 6.9 Hz, H-17）、0.97（3H, s, H-18）、0.78（3H, s, H-19）、1.12（3H, s, H-20）；一组连氧次甲基质子信号 δH 3.08（1H, overlap, H-3）；一组甲氧基信号 δH 3.71（3H, s）。13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）：共 21 个碳信号，低场区含一组苯环碳信号（δC 154.9、147.6、129.7、127.1、126.1、106.7），高场区含 4 个甲基碳信号（δC 17.2、28.3、15.8、24.6，C-17 至 C-20）。综合 1H–1H COSY 谱中观察到的自旋系统（H1–H2–H3、H5–H6–H7、H16–H15–H17）以及 HMBC 相关（H-2 与 C-5/C-10、H-18 与 C-3/C-5、H-6 与 C-8/C-10、H-7 与 C-5/C-8、H-20 与 C-5/C-9、H-11 与 C-8/C-13、H-14 与 C-9/C-12、H-16 与 C-13、13-OCH3 与 C-12），确定了其平面结构。NOESY 谱中可观察到 H-18 与 H-20 的相关，提示 H-20 为 β 构型；H-3/H-5 与 H-19 的相关表明 H-3 与 H-5 为 α 构型。由于 C-15 与其他手性中心空间距离较远，无法通过 NOESY 相关确定其相对构型。因此，对化合物 4 所有可能的构型（4a 与 4b）进行量子化学计算 [23–26]。联合采用 DP4+ 概率分析与线性相关系数（R2）评估，结果表明实验 NMR 数据与构型 4b 的一致性更优：DP4+ 分析给出 99.91% 的统计学置信度，R2 为 0.9979，表明计算化学位移与实测化学位移吻合良好 [27]。通过将计算 ECD 谱与实测 ECD 谱比对，确定其绝对构型为 3S, 5R, 10S, 15S。

化合物 5（新化合物）

化合物 5 为黄色粉末，其 NMR 数据与化合物 4 高度相似，主要差别在于化合物 5 缺少一个甲氧基信号（δH 3.71，δC 55.4）。与文献报道的 (2R,4aS,10aR)-1,2,3,4,4a,9,10,10a-八氢-7-(3-羟基-1-甲基乙基)-1,1,4a-三甲基-2,6-菲二酚 [28] 的 NMR 数据比对，二者基本一致；但 C-15 位的相对构型及绝对构型未能确定。因此采用量子化学计算，通过 R2 与 DP4+ 概率分析评估两种可能构型（5a 与 5b）的可靠性。全部数据的 DP4+ 概率分析给出高达 99.64% 的置信度，线性相关分析的 R2 为 0.9971（计算偏差很小）。结果表明构型 5a 与化合物 5 显著吻合。进一步通过计算 ECD 谱与实测 ECD 谱比对，确定化合物 5 的绝对构型为 3S, 5R, 10S, 15S。

化合物 7（新化合物）

化合物 7 为黄色粉末，HRESIMS 给出明显的加合离子峰 [M + Na]+ m/z 350.17212（C20H25O3NNa 计算值 350.17266），不饱和度为 9。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）：高场区 2 个甲基质子信号 δH 1.12（3H, d, J = 7.0 Hz, H-17）、0.90（3H, s, H-20）；低场区一组芳香质子信号 δH 6.75（1H, s, H-11）、6.67（1H, s, H-14）；另检测到一对连氧亚甲基质子 δH 3.54（1H, dd, J = 10.2, 5.5 Hz, H-16）、3.33（1H, m, H-16）。13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）：共 20 个碳信号，其中芳香碳信号（δC 152.6、143.9、128.4、128.0、124.6、110.6）、一组烯碳信号（δC 154.9、129.1）及一个羰基碳信号（δC 173.7）。1H–1H COSY 谱揭示 C1–C2、C5–C6–C7 和 C15–C16–C17 自旋系统；HMBC 给出 H-2 与 C-4、H-18 与 C-4/C-19、NH 与 C-3/C-4、H-20 与 C-1/C-5/C-9、H-6 与 C-10、H-7 与 C-5/C-9、H-11 与 C-8/C-13、H-14 与 C-9/C-12、H-15 与 C-12/C-14 的相关，据此确定平面结构。相对构型通过 NMR 计算确定：采用量子化学 NMR 方法计算化合物 7 所有合理构型（记为 7a 与 7b），并通过 R2 与 DP4+ 概率分析评估其可能性。结果显示 7a 与化合物 7 的实验数据吻合良好，全部数据的 DP4+ 概率分析给出 99.98% 的高置信度；线性相关分析的 R2 为 0.9984（存在微小计算偏差），但不影响总体结论。通过计算 ECD 谱与实测 ECD 谱比对，化合物 7 的实测 ECD 与 5R,10S,15S-7 的计算曲线吻合良好，故确定其绝对构型为 5R, 10S, 15S。

已知化合物的鉴定

通过将实测 NMR 数据与文献报道数据细致比对，化合物 2、3、6、8、9 分别鉴定为：

• pilearbornol [29]
• rubiarbonone D（云南茜草酮 D）[30]
• margoclin [31]
• abieta-6,8,11,13-tetraene-3β,13-diol（松香烷-6,8,11,13-四烯-3β,13-二醇）[32]
• hinokiol（扁柏酚）[33]

3.3 抗炎活性

常山历来用于治疗疟疾 [34]。值得注意的是，疟疾感染常伴随由 NF-κB 信号通路介导的炎症反应失调 [35,36]。作为炎症调控的核心转录因子，NF-κB 提示常山的抗疟作用与其抗炎特性之间存在潜在关联。已有研究表明，萜类化合物具有显著的抗炎活性，且常通过调控 NF-κB 等关键调节因子实现 [37,38]。作者首先在体外评价了从常山中分离的萜类化合物的抗炎潜力。结果表明，化合物 1 在 12.5 μM 的无细胞毒浓度下即表现出显著的抗炎作用；此外，化合物 4 和 5 也显示出明显活性，并呈剂量依赖性。为进一步阐明其潜在机制，开展了分子对接分析，以评估这些活性化合物与 NF-κB 蛋白（PDB ID：1NFK）[39–41] 的结合亲和力。分子对接分析显示，化合物 1 对 NF-κB 活性位点具有中等强度的结合亲和力，对接打分为 −5.213 kcal/mol [42]。综合这些结果表明，NF-κB 是这些萜类化合物潜在的直接作用靶点，为其抗炎机制提供了分子层面的证据。

3.4 网络药理学揭示多通路协同机制

为阐明常山抗炎作用的分子机制，作者进行了网络药理学分析。首先，通过数据库挖掘预测与这些萜类相互作用的潜在靶点，共识别出 15 个高置信度靶点和 38 个候选靶点。随后的 KEGG 通路富集分析显示，这些靶点在若干炎症相关通路中显著富集 [43]，包括：

• Th17 细胞分化通路
• 神经活性配体–受体相互作用通路
• 类固醇激素生物合成通路
• 化学致癌作用通路

其中，Th17 细胞分化通路直接受 NF-κB 调控，而激素代谢与神经信号转导也与 NF-κB 存在交互作用。这些发现提示，常山中的活性成分不仅通过直接抑制 NF-κB 发挥作用，还通过对激素合成、神经—免疫轴等多条通路实现协同调控。饼图所示的靶点分布凸显了这些成分的多靶点特征；而柱状图中每条通路所对应的基因数量相对有限，则支持一种"多点微调"（multi-point fine-tuning）式的机制，而非对单一靶点的强效干预。

4. 结论

基于结构导向的快速分离策略，从传统抗疟草药常山中靶向分离得到 9 个萜类化合物，其中包括 4 个新化合物，其中一个具有前所未见的骨架。所有化合物的结构均通过系统的波谱分析、量子化学计算、计算机辅助结构解析以及 X 射线单晶衍射得到明确确证。鉴于疟疾感染常伴随炎症反应失调，作者对所分离化合物的抗炎活性进行了评价，多个化合物表现出中等强度的抗炎活性。分子对接技术被用于验证活性化合物与核心炎症转录因子 NF-κB 的结合亲和力，结果与其抗炎效应呈正相关。此外，网络药理学分析揭示，这些化合物可能通过调控多条炎症相关通路发挥协同效应。本研究为常山的传统抗疟用途提供了现代药理学诠释，并为抗炎药物的开发奠定了基础。

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