基于 CASE、DFT 及原子力显微镜技术辅助复杂天然产物的结构确证
来源：微信公众号「凯美科」
分类：未知物从头解析案例
发布：2020-06-19
作为行业内最著名的专业化学软件公司Advanced Chemistry Development Inc. （简称ACD/Labs）推出的计算机辅助化合物结构解析软件Structure Elucidator Suite，其CASE（Computer Assisted Structure Elucidation）技术算法可以很好的帮助科学家进行基于实验数据的未知化合物结构快速确认，强大的解谱功能为研究者在阐明和确定天然产物、杂质、降解物、代谢物等未知结构方面提供了极大帮助。本文介绍一个基于CASE、DFT及原子力显微镜技术辅助复杂天然产物结构确证的案例，向大家介绍该软件的实际应用。
案例文献来源：
A Combined Atomic Force Microscopy and Computational Approach for the Structural Elucidation of Breitfussin A and B: Highly Modified Halogenated Dipeptides from Thuiaria breitfussi. Kine Hanssen, Bruno Schuler, Antony J. Williams.
Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 12238 –12241
作者通过对北极水螅虫类的Thuiaria breitfussi样品进行MeOH/CH2Cl2提取、液液萃取及质谱导向的HPLC纯化获得新化合物Breitfussin A (1) 6.2 mg及Breitfussin B (2) 4.0 mg。
依据高分辨质谱确定化合物1和2的分子式分别为C16H11N3O2BrI和C16H11N3O2Br2，且根据二级/三级质谱碎片确认化合物1中包含I、CH3O、Br、CH3等原子和基团。通过1H NMR（DMSO-d6及Methanol-d4）、13C NMR及COSY信息可分别推测出化合物1和2中分别包含取代吡咯及3,4,6-取代吲哚片段（图1中a,b）；继续分析三级质谱及二维核磁NOE谱图可进一步获得各个氯原子及甲氧基的取代位置（图1中c,d）。但两个化合物中剩余基团C3NO及两个片段间的连接方式则难以通过NMR谱图或MS技术进一步确认。
图1 化合物1、2解析片段
为了确认化合物中剩余官能团的连接形式及准确结构，作者通过使用原子力显微镜技术进行研究，并推导出化合物1的候选结构（如图2中f所示）。
图2 化合物1 AFM分析
为了进一步分析且更加真确、详细的阐述化合物结构，作者通过ACD/Structure Elucidator软件系统依据对核磁谱图数据进行CASE计算，列举所有理论可能的不同连接方式的化学结构，通过精确的核磁预测算法将候选物的理论计算值与实验值进行比对并依据偏差值进行排序，以获得最优结果。
将相关数据导入ACD/Structure Elucidator软件系统。分子式C16H11N3O2BrI；13C谱包含16个信号；HSQC谱包含7个信号，并且以此鉴定谱图中存在1个CH3，6个CH，9个C；28个HMBC信息依据相对峰强度分为两组，7个2-3J相关峰，21个2-5J相关峰；7组COSY相关峰；6组ROESY相关峰。
第一次计算：
依据经验手动标记以下信息（如图3）
- 一个明确的吡咯环
- 两个活泼氢信号δ11.94，11.78 ppm定义为两个NH
- δ55.7ppm的CH3定义为甲氧基信号，并依据HMBC信号连接于δ153.62ppm的季碳
- 定义除了δ55.7ppm CH3信号外的所有碳原子为sp2杂化状态
- 依据碳化学位移信息将碘原子连接于δ83.94ppm的碳原子
- 依据HMBC信号将δ153.62ppm的碳原子与δ104.28，107.92ppm相连
依据以上信息，软件自动生成MCD（Molecular Connectivity Diagram）分子连接图
图3 化合物1的MCD图，蓝色原子为sp3杂化，红色原子为sp2杂化；黑色线条为用户自定义连接，绿色为2-3J连接，蓝绿色为2-5J连接；A表示从谱图中提取的相关信息连接图，B表示由于碳原子化学位移值差异太小引起的模糊相关，C表示用户自定义俩接
软件计算设置相关限定：
- 杂原子之间禁止直接相连接
- 3-5元环禁止包含三键
- 3元环禁止包含双键
- 禁止生成桥接芳香环结构
结果：
2小时内生成366,414个化学结构，通过神经网络算法对所有结构进行预测计算，并与实验值对比，依据差异度排序，罗列9个差异度最小的结构，其中最小偏差为2.888。（如图4）
图4 第一次计算结果，并依据偏差值排序
对比计算所得结构，未获得与AFM结果一致的化学结构。接下来作者修改部分参数信息，进行第二次计算。
第二次计算：
第二次计算舍弃部分自定义连接键，δ153.62-δ109.02ppm，δ153.62-δ104.28ppm，其他条件不变。48小时内生成4,545,009个化合物结构，依据同样方式对候选物进行计算排序，罗列9个差异度最小的结构，其中最小偏差为2.194，小于第一次计算中的最优结构偏差值（2.888），且与AFM所得结构一致。同时也进一步确认恶唑环的存在以及碘原子的链接位置（如图5）。
图5 第二次计算结果，并以偏差值排序
分析第一次与第二次计算结果的差别（排序第一的化合物），用户自定义的δ153.62-δ109.02连接不能与化学结构准确对应，并且引起计算错误。依据HMBC的信号只能说明两个碳原子之间存在1-2键的连接的可能，并不能说明直接相连。因此在应用ACD/Structure Elucidator软件进行化合物结构确认过程中，用户可依据经验及实验数据自定义原子间的准确连接关系，为了降低错误率，应尽可能避免加入不确定或错误的连接情况。
作者为了尽可能详细的描述测化学结构，并验证计算结果，利用DFT密度泛函理论对恶唑环可能的结构的进行理论计算，计算结果与之前通过ACD/Structure Elucidator计算结果完全吻合（如图6）。
图6 DFT对化合物1同分异构计算结果
ACD/Structure Elucidator软件应用CASE系统系统根据1D&2D NMR、MS、UV、IR等各种实验数据，依靠精确强大的算法对有机化合物进行自动结构解析。该软件可以为用户结构解析工作流提供多种不同的方案，如生成一系列完整的匹配于实验数据的化学结构，或为疑似化合物提供替代方案，或通过其他分析数据来限定化合物的范围及化学可能性等，所有这些都可以更快速、更高效的帮助用户进行化合物结构解析。ACD/Structure Elucidator强大的解谱功能为光谱分析专家在阐明和确定未知化合物、杂质、天然降解物、代谢物等未知结构方面提供了极大帮助。
