Eleutherlenes A–D：红葱中分离的抗炎萘衍生物

本研究从红葱（Eleutherine bulbosa）中分离鉴定出四个结构新颖的萘醌类化合物，包括：Eleutherene A (1)—— 首例具有芳环稠合6-甲基-2,7-二氧杂双环 [3.2.1] 辛烷特征骨架的萘醌衍生物；Eleutherene B (2)——含a,b-不饱和g-内酰胺与四氢吡喃杂环体系的新型萘醌化合物；以及两个萘醌生物碱新结构 Eleutherenes C (3) 和 D (4)。综合运用多维核磁共振波谱分析、计算机辅助结构解析（ACD/Structure Elucidator Suite）、量子化学计算及 X 射线单晶衍射分析等技术手段，完成了化合物的立体化学确证。首次提出了化合物1和2的合理生物合成途径，揭示了其可能的生源合成机制。值得注意的是，化合物1表现出显著的抗炎活性，在LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞模型中，可有效抑制一氧化氮（IC₅₀ = 9.5 ± 0.3 μM）、白介素-1b（IL-1b）等促炎介质的产生，并显著下调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的表达水平。机制研究表明，该化合物通过双重调控作用抑制炎症反应：一方面通过阻断IκB激酶复合体（IKKa/b）磷酸化抑制NF-κB信号通路，同时抑制 MAPK 信号通路中c-Jun氨基末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶（Erk1/2）的活化；另一方面通过激活Keap1/Nrf2抗氧化通路，上调醌氧化还原酶（NQO1）和血红素加氧酶-1（HO-1）的表达，从而降低细胞内活性氧（ROS）水平。

萘衍生物是一类广泛存在于植物和微生物中的天然产物，以其结构多样性和丰富的生物活性而备受关注。这类化合物具有抗癌、抗菌、抗氧化、细胞毒、抗炎和抗原虫等多种药理作用^[1-3]。作为双环芳香化合物，萘衍生物能够与受体位点形成强π-π堆积作用和范德华力，因此被认为是药物研发中的优势骨架。事实上，许多已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物，如萘夫西林（抗菌药）、托萘酯（抗真菌药）、普萘洛尔（心血管药）、度洛西汀（抗抑郁药）和萘普生（非甾体抗炎药），均含有萘环亚结构^[4,5]。因此，发现具有高效生物活性的新型天然萘衍生物，将为有机合成、化学生物学和药理学研究提供重要的物质基础。

鸢尾科植物红葱（Eleutherine bulbosa (Mill.) Urb.）是一种主要分布于非洲、南美洲、东南亚和中国华南地区的草本植物。其红色球茎在民间医学中被广泛用于治疗风湿病、糖尿病、乳腺癌、心脏疾病和肠道感染^[6,7]。前期研究发现，该植物的主要药效成分为蒽醌类和萘衍生物，这些成分表现出抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗癌等多种生物活性^[8-10]。受到红葱中多种生物活性萘类成分的吸引，并延续本课题组从药用植物中发掘天然抗炎剂的研究方向^[11-15]，我们对采自中国云南省的红葱球茎进行了系统的化学研究。最终，我们成功分离并鉴定出四个结构新颖的萘类化合物——eleutherlenes AD（14，如图1所示），并详细阐述了它们的分离纯化、结构鉴定、生物合成推测以及抗炎活性研究结果。

图1. 化合物1-4的化学结构

化合物Eleutherlene A（1）的分子式经高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）确定为C₂₀H₁₈O₅，其准分子离子[M + H]⁺峰为m/z 339.1230（计算值m/z 339.1227），结合一维核磁数据可推算出12个不饱和度。¹H和¹³C NMR谱（如表 1所示）显示存在13个sp²杂化碳原子（含一个羰基碳δ_C 179.7及12个烯基碳），提示该化合物具有五环骨架结构。通过DEPT和HSQC谱解析剩余碳信号，确认包含三个甲基、一个亚甲基及三个次甲基（其中一个是连氧次甲基δ_C 88.2/δ_H 4.73，两个缩醛次甲基 δ_C 100.3/δ_H 6.01）。

表1. 化合物1在C₅D₅N中的¹H和¹³C NMR数据

综合一维和二维NMR数据分析，化合物1由亚结构A和B组成（见图2）。

图2. 化合物1的关键¹H-¹H COSY和HMBC相关性

基于一维及二维核磁共振数据的综合分析，化合物1被解析为由A和B两个结构片段单元组成（图 S1）。在平面共轭体系中，HMBC谱中观测到的远程⁴J_CH相关峰^[16-17]为后续结构解析提供了关键信息。特征性¹H/¹³C共振信号及HMBC相关峰显示：H₃-12（δH 2.30）与C-2（δC 164.0）、C-3（δC 113.4）的远程耦合（ⁿJ_C,H=8和1 Hz）；H-3（δH 6.39）与C-4（δC 179.7）、C-4a（δC 118.0）的相关性；H₃-11（δH 3.19）与C-4a、C-5（δC 136.7）、C-6（δC 120.9）、C-10b（δC 158.3）的关联；H-6（δH 7.68）与C-7（δC 114.3）、C-10a（δC 109.8）、C-10b 的三键相关；H-9（δH 6.99）与C-7、C-8（δC 154.2）、C-10、C-10a、C-10b 的跨环耦合，以及LR-HSQMBC¹⁸谱中H₃-12/C-10b的四键相关信号，共同构建出结构单元A的萘环母核。

通过¹H-¹H COSY相关峰（H-1′/H₂-2′/H-3′和H₃-5′/H-4′）及HMBC交叉峰：H-3′（δH 3.71）与C-6a、C-8的耦合；H-4′（δH 4.73）与C-7（δC 114.3）、C-1′（δC 100.3）、C-2′（δC 30.9）的远程相关；H₃-5′（δH 1.24）与 C-3′（δC 36.8）、C-4′（δC 88.2）的关联；H-1′（δH 6.01）与C-8的耦合，最终确定五碳单元B为6-甲基-2,7-二氧杂双环[3.2.1]辛烷结构单元，并与萘环母核形成稠环体系。由此，化合物1的平面结构被解析为萘环与特殊双醚环结构形成的共轭体系。

化合物1的相对构型通过分析其NOESY数据确定（如图3所示），其中H₃-5′/H-2′b的相关性表明C-2′亚甲基桥和H₃-5位于分子的同一侧，而H-1′和H-3′位于分子的另一侧。最后，通过在甲醇中使用IEFPCM溶剂模型进行TDDFT-ECD计算¹⁹,²⁰（计算水平为B3LYP/6-31G*//ωb97xd/6-31G**），确定了化合物1的绝对构型为1′R, 3′R, 4′R（见图4）。

图3. 化合物1的关键NOESY相关性

图4. 化合物1的实验和计算ECD光谱

化合物Eleutherlene B (2)为黄色晶体，根据HRESIMS检测到的m/z 330.1320 [M + H]⁺离子峰（计算值 m/z 330.1336）及¹³C NMR 数据，确定其分子式为 C₁₈H₁₉NO₅，不饱和度为10。

对一维核磁共振（1D NMR）谱图（见表2）的解析显示了典型的1,2,3-三取代芳环的化学位移信号[δH 7.73（1H，dd，J = 7.9, 0.8 Hz），δC 119.1；δH 7.52（1H，dd，J = 8.7, 7.9 Hz），δC 131.1；δH 7.27（1H，dd，J = 8.7, 0.8 Hz），δC 118.1]，一个三取代双键的信号[δH 5.96（1H，d，J = 1.4 Hz），δC 115.6]，以及四个非质子化的sp²碳原子（δC 160.1, 157.2, 134.7和123.0），它们构成了上述两个官能团。此外，谱图中还显示了两个羰基（δC 194.9和171.6）、三个甲基（其中一个是甲氧基）、两个亚甲基（其中一个是连氧亚甲基）、一个连氧次甲基及两个氧取代叔碳原子。上述信息表明，化合物2是一种四环生物碱。由于存在连续的非质子化碳原子以及前所未有的骨架结构，化合物2的平面结构解析具有较大挑战性。

表2. 化合物2的¹H和¹³C NMR数据

对于芳香环A环及其取代基的识别：1,2,3-三取代的芳香A环及其取代基是通过¹H-¹H COSY相关性H-6/H-7/H-8以及HMBC相关进行识别的（如图5所示）。具体相关峰包括：H-6（δH 7.73）与C-5（δC 194.9）的相关性；H-7（δH 7.52）与C-5a（δC 134.7）和C-9（δC 157.2）的相关性；H-8（δH 7.27）与C-9a（δC 123.0）和C-10（δC 87.5）的相关性；以及CH₃O-9（δH 3.97）与C-9（δC 157.2）的相关性。

图5. 化合物2的关键¹H-¹H COSY和HMBC相关性

α,β-不饱和γ-内酰胺C环的识别：通过¹H-¹H COSY 相关（H-6/H-7/H-8）及 HMBC 交叉峰（见图 5）：H-6（δH 7.73）与C-5（δC 194.9）、H-7（δH 7.52）与 C-5a（δC 134.7）及C-9（δC 157.2）、H-8（δH 7.27）与C-9a（δC 123.0）及 C-10（δC 87.5）、以及CH3O-9（δH 3.97）与C-9（δC 157.2）的远程耦合，明确A环为1,2,3-三取代芳香环体系。δH 7.77处可交换质子与C-1（δC 115.6）、C-10（δC 87.5）、C-10a（δC 160.1）及C-11（δC 171.6）的HMBC相关，结合H-1（δH 5.96）与C-10、C-11的耦合，证实存在α,β-不饱和γ-内酰胺C环。

六元环（B环）的构建：通过COSY 相关（H3-12/H-3/H2-4和H2-1′/H3-2′）及HMBC交叉峰：H2-4（δH 2.20/1.90）与C-4a（δC 82.3）、C-5、C-10a的关联，H2-1′（δH 3.77）与C-4a的远程耦合，解析出C-4a位连接的乙氧基和 2 - 氧取代丙基片段，共同构建六元B环。

C-3和C-10之间的醚键连接：最后，通过化学位移、H₃-12（δH 1.18）与C-10的HMBC相关性以及剩余一个不饱和度和分子式的要求，推断出C-3（δC 66.7）和C-10（δC 87.5）之间通过醚键相连。

为确证上述结构解析的可靠性，本研究采用计算机辅助结构解析系统（computer-assisted structure elucidation, CASE）——ACD/Structure Elucidator（ACD/SE）进行验证分析。基于分子连接图（Molecular Connectivity Diagram, MCD）生成60个候选异构体，经多级筛选后获得5个符合度较高的结构（如图 6所示）。其中匹配度最优的 ID=1 结构通过以下计算参数得到验证：基于HOSE 码算法（d_A）与神经网络算法（d_N）的¹³C核磁化学位移偏差值分别为d_A (¹³C)=2.380（v.14.59）/DP4_A (¹³C)=99.14%和d_N (¹³C)=1.870/DP4_N (¹³C)=99.99（见图6）。该计算结果与实验数据高度吻合，充分证实该结构即为化合物 2 的正确结构。

图6.化合物2的分子连接图（MCD）及排名前五的候选结构

绝对构型的确定基于实验与计算ECD曲线的高度吻合（图 S3），最终指定为3S, 4aR, 10R。同样通过氯仿中培养的单晶，采用Cu Ka进行X射线衍射实验，确证了上述结构解析结果（图3，CCDC 2393547，绝对结构参数0.02 (9)）。

图7.化合物2和4的单晶结构

略。(详见原文)

化合物1和2的合理生物合成途径如图8 所示。其聚酮骨架的形成始于乙酰辅酶A（CoA）起始单元与六个丙二酰CoA延伸单元通过连续的脱羧及Claisen酯缩合反应，生成七酮基中间体。该中间体随后经历芳构化与氧化反应，生成已知化合物eleutherinol (5)及关键中间体M。关键前体4,5-二羟基戊-2-烯醛（可来源于天然产物2-脱氧D-核糖和3-脱氧D-木糖²²）与5发生Friedel-Crafts反应生成中间体I-1。I-1通过C-1′与8-OH的分子内缩醛化及还原反应形成含六元环的中间体I-2，后者脱水生成Eleutherlene A (1)。

图8. 化合物1和2的推测生物合成途径

对于化合物2，中间体M经酮基还原反应转化为M-1。随后，L-丙氨酸参与的关键转氨化反应作用于M-1生成M-2，该中间体通过脱水与环氧化反应转化为M-3。M-3的亚胺基对环氧乙烷进行碱驱动亲核进攻，随后脱水形成含吡咯环的M-4。最终，M-4通过氧化、开环重排及分子内亲核进攻等多步修饰生成Eleutherlene B (2)。

通过检测化合物1-4对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO的抑制作用（图 4A），发现化合物1具有显著的NO抑制活性（IC₅₀ = 9.5 ± 0.3 μM，图 S4A），且对细胞存活率无影响（>90%，图S4B）。ELISA实验表明，1能浓度依赖性降低IL-1β分泌水平（图 4B）。Western blot分析显示，1可剂量依赖性下调COX-2和iNOS蛋白表达（图 4C,D）。进一步通过免疫印迹分析LPS刺激巨噬细胞中NF-κB和MAPK 信号通路发现：1通过降低NF-κB、IκB-α、IKKα/β的磷酸化水平显著抑制NF-κB通路激活（图4E,F）；同时抑制JNK和Erk1/2的磷酸化（图4G,H）。流式细胞术显示，LPS处理引发活性氧（ROS）过量生成，而1通过激活Keap1/Nrf2信号通路，促进下游酶NQO1和HO-1的表达，有效降低细胞内ROS水平（图4I-L），从而抑制氧化应激介导的炎症反应。

图 4. (A) 化合物1-4在LPS诱导的RAW 264.7细胞中通过亚硝酸钠定量检测显示的NO生成抑制效应。(B) 化合物1对RAW 264.细胞IL-1β释放的调控作用。(C、D)化合物1分别对iNOS和COX-2蛋白表达的抑制作用。(E、F)化合物1对IKKα/β磷酸化(p-IKKα/β)、IκB-α 磷酸化(p-IκB-α)及NF-κB信号通路关键蛋白(p-NF-κB)表达的调控。(G、H) 化合物1对MAPKs信号通路中JNK和Erk蛋白磷酸化水平的影响。(I、J) 化合物1对RAW 264.7细胞内活性氧(ROS)水平的调控作用。(K、L)化合物1对Nrf2/Keap1通路相关蛋白（HO-1、NQO1）表达的促进作用。实验均以β-肌动蛋白作为内参，数据以均值 ± 标准差表示（n=3）。统计显著性标注：#表示与对照组比较（##p < 0.01，###p < 0.001）；*表示与LPS模型组比较（*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001）。