天然产物 Wheldone 的结构修订
Oberlies等[1]通过构建Aspergillus fischeri (NRRL 181)与Xylaria flabelliformis (G536)的真菌共培养体系，成功分离获得一个结构新颖的天然产物Wheldone (A)。研究人员综合运用一维和二维核磁共振技术，结合质谱分析，完成了该化合物的结构鉴定。活性测试表明，Wheldone (A)对乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤细胞系均表现出显著的细胞毒活性。
A
基于文献数据，本案例采用Structure Elucidator Suite软件对化合物 A进行结构解析验证。该化合物呈白色无定形粉末状，其分子式经高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）测定为C25H34O6，并通过1H NMR、13C NMR、HSQC(经编辑的)及HMBC等核磁共振数据进行系统确证。相关核磁共振数据详见表1。
将上述数据输入软件后，程序自动生成了如图1所示的分子连接图（Molecular Connectivity Diagram，MCD）。
图1. Wheldone的分子连接图(MCD)
完成MCD中HMBC数据的矛盾性检查后，系统提示："检测到至少1个非标准连接"，表明HMBC谱图中存在跨越三个以上化学键的长程相关信号。根据程序建议，我们采用模糊结构生成（Fuzzy Structure Generation, FSG）方法[2]进行处理。系统自动选择参数，执行FSG结合13C化学位移计算，整个结构生成过程仅耗时5秒，经过筛选后最终获得36个候选结构（初始生成97个结构）。
随后，我们运用Structure Elucidator软件内置的三种算法（HOSE算法、神经网络算法和增量法）对所有候选结构进行13C化学位移预测。根据预测化学位移与实验值的平均偏差进行排序，最终筛选出最优的六个候选结构如图2所示。
图2. 输出文件中排名前六位的候选结构
13C化学位移预测采用三种方法：基于HOSE算法、神经网络算法和增量法。各方法计算所得13C化学位移的平均偏差分别标记为dA、dN和dI。各原子按其实验值与计算值的差异进行颜色标注：绿色表示差异在0-3 ppm之间，黄色>3-15 ppm，红色>15 ppm。红色箭头指示程序在模糊结构生成过程中检测到的非标准HMBC相关信号。
最优结构（编号#1）在所有三种计算方法中均表现出最小的平均偏差值。然而，基于HOSE算法对5号碳原子化学位移的预测值与实验值存在20 ppm的显著偏差（该原子标为红色），而其余原子的预测值与实验值均高度吻合。经分析发现，HOSE计算的后台数据库中缺乏足够的结构片段来精确计算5号原子的化学位移——现有数据库仅能提供2层球面（shell）内的相似结构片段，导致预测结果存在较大不确定性。
为验证结构#1的正确性，我们对图2所示的六个候选结构进行了DP4概率分析。
图3. 结构正确性概率分析
图3数据显示结构#1的正确性概率达到100%。但该结构中存在的"红色标记原子"（化学位移预测偏差超过15 ppm）表明仍需通过补充实验或DFT化学位移计算进行进一步验证。值得注意的是，文献作者最初提出的结构A[1]并未出现在本次结构生成结果中。
图4对比展示了结构A与结构#1的差异。可以看出，结构A包含多达6个非标准HMBC相关信号，而结构#1仅存在1个此类信号。文献作者[1]在推导结构A时放宽了对HMBC相关信号长度的限制。由于Structure Elucidator软件[2]默认将HMBC相关信号严格限定在2-3个化学键范围内，这一算法设置导致结构A无法被自动生成。
图4. 结构A与结构#1中的非标准HMBC相关信号对比
为验证结构A的合理性，我们将其分子结构输入Structure Elucidator程序进行13C化学位移计算。如图5所示，三种计算方法（HOSE算法、神经网络法和增量法）均显示出显著的化学位移偏差（平均偏差>15 ppm），这一系统性偏差充分证明该结构存在根本性错误。值得注意的是，若研究者在结构解析阶段进行此类计算化学验证，应当能够及时发现其结构假设的缺陷。
研究团队在后续研究中[3]对结构A进行了修正，并最终确证了结构#1的正确性。此次研究结合HMBC和1,1-HD-ADEQUATE实验数据，辅以DFT计算的NMR化学位移预测和晶体学分析，多维度验证了结构#1的可靠性。
修正后的wheldone结构及其13C化学位移归属如下所示：
本案例研究充分证明了利用快速经验方法进行NMR化学位移预测对验证结构假设的重要性。通过实证分析可见，这类验证在绝大多数情况下能够有效避免错误结构的推导与发表。
参考资料：
1. Knowles, S. L.; Raja, H. A.; Isawi, I. H.; Flores-Bocanegra, L.; Reggio, P. H.; Pearce, C. J.; Burdette, J. E.; Rokas, A.; Oberlies, N. H. Wheldone: Characterization of a Unique Scaffold from the Coculture of Aspergillus fischeri and Xylaria flabelliformis. Org. Lett. 2020, 22, 1878−1882.
2. M.E. Elyashberg, A.J. Williams. Computer-based Structure Elucidation from Spectral Data. The Art of Solving Problems. Springer, Heidelberg, 2015, 454 p. https://www.springer.com/978-3-662-46401-4
3. M. Rangel-Grimaldo, C. E. Earp, H. A. Raja, J. S. Wood, L. Mardiana, K. L. Ho, A. Longcake, R. T. Williamson, L. Palatinus, M. J. Hall, M. R. Probert, N. H. Oberlies. Wheldone Revisited: Structure Revision Via DFT-GIAO Chemical Shift Calculations, 1,1-HD-ADEQUATE NMR Spectroscopy, and X‑ray Crystallography Studies. J. Nat. Prod. 2024, 87, 8, 2095–2100