天然产物 Peganutonin A 的结构修正

结构鉴定是天然产物化学研究的核心挑战之一。尽管现代分析技术（如高分辨质谱和二维核磁共振）已取得显著进展，但结构误判现象在天然产物研究中仍屡见不鲜^[1,2]。近年来，计算机辅助结构解析（CASE）技术与量子化学计算方法的联合应用，特别是结合密度泛函理论（DFT）的DU8ML等创新方法，为复杂天然产物的结构确证提供了新的解决方案^[3,4]。

Liu等近期从传统药用植物骆驼蓬（Peganum harmala L.）种子中分离获得peganutonin A（图1），并报道其具有独特的N-乙酰基环脲骨架结构^[6]。该植物作为重要的民族药用资源，在中国传统医学及中亚、地中海等地区的传统医疗体系中具有悠久的应用历史^[5,7]。值得注意的是，与peganutonin A共分离的化合物包括褪黑素、pegaharmine F以及骆驼蓬碱(harmaline)等次生代谢产物（图1）。初步药理学研究表明，peganutonin A对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO生成表现出中等抑制活性（IC50 = 20.7 μM），这一药理活性进一步增加了该假定天然产物的研究价值^[6]。

图1. Peganutonin A (1)及相关天然产物的结构式

值得注意的是，尽管peganutonin A最初被归类为褪色素类似物，但其结构特征与典型褪色素衍生物存在显著差异：一方面，甲氧基取代位置明显不同；另一方面，研究者提出了其可能通过色氨酸生物合成途径形成的假设。然而，通过对原始实验数据的系统复核发现，其¹H NMR谱中存在三个被忽视的关键信号：6.02 ppm处的宽单峰（1H）、1.26 ppm处的三重峰（6H）以及3.48 ppm处的四重峰（4H）（支持信息图S1）。这些被忽略的质子信号在¹³C NMR谱中也有对应体现（13.8和41.7 ppm），并通过HSQC实验证实了其相关性。这一发现对最初提出的结构解析提出了重要质疑。

图S1：分离得到的Peganutonin A核磁共振数据中部分主要峰位未指认的标记谱图

根据核磁共振谱图的裂分模式和化学位移特征分析，这些被忽略的信号很可能来源于二乙氨（-N(CH₂CH₃)₂）结构单元。值得注意的是，Liu等研究者将这些信号简单归因于分离过程中可能引入的二乙胺残留^[8]，然而这一解释存在多处疑点：首先，原始实验步骤中并未提及使用二乙胺作为分离试剂；其次，文献报道的二乙胺特征信号（¹H NMR：δH 1.11和2.66 ppm^[9]；¹³C NMR：δC 15.4和44.0 ppm^[10]）与观测信号存在显著差异；更重要的是，实验记录显示peganutonin A是从酸性提取物（2% HCl溶液）中分离获得，但所提出的结构中却不含任何可质子化的碱性基团。此外，作者还报道了旋光度数据，而所提出的结构中却不含手性中心。

这些累积的光谱学异常现象和分离过程的不一致性，对peganutonin A的初始结构归属提出了根本性质疑。为系统解决这些结构争议，我们采用多维度研究策略：首先基于已报道的实验数据开展计算机辅助结构解析（CASE）分析。具体而言，我们将初始结构1导入ACD/Structure Elucidator Suite专家系统^[11]，利用该平台整合的三种经验性计算方法预测¹³C NMR化学位移：1）基于HOSE算法（Hierarchically Ordered Spherical Environment）的片段匹配法；2）人工神经网络算法；3）化学位移增量法。通过计算化学位移预测值与实验值的平均偏差（分别表示为d_A、d_N和d_I），对结构合理性进行定量评估（图2）。

图2. Liu等^[6]提出的peganutonin A (1)的Structure Elucidator Suite分析结果。

各碳原子按其实验值与计算值¹³C化学位移差值进行颜色标记：绿色表示差值在0-3 ppm范围内，黄色表示差值>3-15 ppm。

计算机辅助结构解析（CASE）的分析结果表明，虽然结构 1 的平均偏差（d_A/d_N/d_I）和最大偏差值尚未达到完全否定的阈值，但值得注意的是，超过50%的碳原子被标记为黄色（化学位移偏差>3 ppm），这一显著异常现象使得该结构的可靠性受到严重质疑。基于定量分析结果，我们判定最初提出的结构 1存在重大不确定性。

为进一步探究peganutonin A的真实结构，我们基于Liu等报道的分子式（C₁₃H₁₄N₂O₄）和全套核磁数据，包括HMBC和COSY谱，在Structure Elucidator Suite软件平台中构建了分子连接图（Molecular Connectivity Diagram，MCD），如图3所示。

图3. 基于Liu等^[6]报道的分子式C₁₃H₁₄N₂O₄及核磁数据构建的peganutonin A分子连接图(MCD)

通过系统的结构生成算法和¹³C NMR化学位移预测分析，我们共获得五个符合分子式C₁₃H₁₄N₂O₄的候选结构。值得注意的是，Liu等最初提出的结构1（见支持信息图S2）在预测化学位移与实验值的匹配度上仍表现最佳（平均偏差最小），因此被保留为最可能的候选结构。其余结构则因存在过大偏差或化学不合理性而被排除。

图S2：按d_A值升序排列的输出结果

研究结果表明，原始文献中提出的分子式C₁₃H₁₅N₂O₄需要重新验证。通过高分辨质谱（HRMS）数据的系统分析，我们获得了以下关键发现：

图4. 重新指认的peganutonin A结构（5）及其在质谱分析中可能发生的特征裂解途径。

为验证这一假设，我们采用机器学习增强的DFT计算方法DU8ML^12,13，基于修正后的分子式对更符合观测化学位移（即化学合理性）的结构进行了精确的¹³C NMR化学位移计算。如表1所示，预测结构的计算化学位移与peganutonin A实验数据高度吻合（均方根偏差RMSD=1.57 ppm，平均绝对误差MAE=1.21 ppm）。最大偏差出现在乙酰胺羰基（-3.58 ppm），这很可能是由该酰胺基团浓度依赖的氢键二聚作用所致。更多细节及碳原子归属详见支持信息。

表1. 实验值与DU8ML计算的¹³C NMR化学位移数据对比

为验证结构5的合理性，我们基于修正后的分子式C₁₇H₂₅N₃O₄，结合先前被忽略的核磁共振信号[δC 41.7 ppm (δH 3.40)和14.1 ppm (δH 1.10)]，采用计算机辅助结构解析（CASE）方法进行了系统分析。通过Structure Elucidator Suite软件构建分子连接图（MCD，图5）后，首轮结构生成获得20个可能结构。将这些结构与截断数据集结果合并，并经过化学合理性筛选（包括去除不稳定互变异构体等处理），最终获得统一的结构解决方案。图6展示了经系统评估后排名前四位的候选结构。

图5. 基于分子式C₁₇H₂₅N₃O₄及修正后NMR数据生成的分子连接图（MCD）

图6. 按d_A值升序排列的统一输出文件中排名前四的结构。

图7. CASE/ACD-DU8ML预测结构5的全合成路线

通过系统的核磁共振数据比对（见支持信息），我们发现合成化合物5的¹H和¹³C NMR谱与文献报道的peganutonin A数据完全一致，这一结果确凿地证实了原始结构存在误判，其正确结构应为N,N-二乙基脲衍生物5。需要特别指出的是，二乙氨基在天然产物中极为罕见^[19]，结合分离过程中使用了N,N-二乙胺的实验事实，可以合理推断peganutonin A (5) 实际上是分离过程中产生的人工产物。

机理研究表明，骆驼蓬（P. harmala）中的特征生物碱harmaline (4)在单线态氧存在下容易发生光氧化反应，进而与N,N-二乙胺反应生成peganutonin A (5)。这一转化过程可能通过形成与5结构相似的苯胺中间体9和10来实现^[20]，提示peganutonin A (5)可能是光氧化产物10在提取过程中与大气CO2和二乙胺反应的产物。虽然文献中关于此类反应直接生成脲结构的报道较为有限^[21]，但我们提出了另一种可能的形成途径（图8）：在合适光敏剂存在下，harmaline (4)首先与单线态氧反应生成亚胺离子11^[22]，随后被二乙胺捕获形成N,N-氨基缩醛12；该中间体经过氧化物还原触发裂解得到化合物15，再通过第二次光氧化切断富电子烯键，最终经由亚胺离子17转化为peganutonin A (5)。

图8. 修正结构peganutonin A的可能形成机制

实验部分

(略)