Indopexines A 和 B：源自真菌 Aspergillus sp. TJ507 的异吲哚啉生物碱
通过综合光谱分析、CASE算法、量子力学核磁共振氢谱与碳谱的DP4+分析以及电子圆二色性计算，确定了它们的结构。
从结构上看，化合物1是首个基于2-氧杂-10-氮杂四环[7.7.0.01,12.03,8]十六烷骨架、具有6/5/5/6环系的异吲哚啉生物碱；而化合物2则具有5,20-二氧杂-1-氮杂五环[10.7.1.01,12.06,11.013,18]二十烷结构单元。
此外，化合物1通过Rap1/PI3K/AKT信号通路对三阴性乳腺癌细胞表现出抑制作用。
三阴性乳腺癌（TNBC）作为乳腺癌中最棘手的亚型，与预后不良、高转移倾向及治疗手段有限密切相关。其约占全球乳腺癌病例的15-20%，被称为"乳腺癌之王"。由于缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和HER2表达，包括内分泌治疗和HER2靶向药物在内的大多数有效乳腺癌治疗方案对TNBC疗效有限。
尽管数十年对TNBC发病机制的研究已取得丰硕成果，但目前其主要治疗方式仍以手术、放疗和化疗为主，这凸显了深入开展抗TNBC治疗研究的迫切性。
值得注意的是，天然产物（如紫杉醇和蒽环类药物）已成为抗TNBC研究中不可或缺的生物活性分子宝库。从真菌中发掘具有抗癌活性和新颖结构的天然产物一直是我们课题组的长期研究方向。
异戊二烯异吲哚啉生物碱（Prenylated isoindoline alkaloids，PIDAs）主要来源于曲霉属、链格孢属、裸孢壳属等真菌，是一类具有迷人结构和多种生物活性的天然产物，包括抗病毒、纤溶酶原调节、抗高血脂和抗疟活性。其特有的异吲哚啉结构单元使该类化合物成为天然产物发现领域的热点分子。
然而其中仅有aspernidine A被证实通过非核糖体肽合成酶-聚酮合酶（NRPS-PKS）杂合途径生物合成，并涉及异戊二烯转移酶和细胞色素P450单加氧酶等后修饰酶。因此亟需发掘具有独特治疗潜力的结构复杂且多样化的PIDAs。
基于本课题组在真菌源新颖生物活性天然产物发现方面的研究积累，我们进一步对曲霉属真菌TJ507的大米提取物进行研究，分离获得两个具有全新2-氧杂-10-氮杂四环[7.7.0.01,12.03,8]十六烷和5,20-二氧杂-1-氮杂五环[10.7.1.01,12.06,11.013,18]二十烷骨架的PIDAs类新化合物indopexine A (1) 和 B (2)（图1）。
图1. 化合物1和2的结构式
本文系统阐述了这两个化合物的分离纯化、结构解析、生物合成途径及生物活性评价。
为黄色油状物，通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）中m/z488.2040[M + Na]+的正离子峰（C27H31NO6Na+理论计算值488.2049）确定其分子式为C27H31NO6，对应13个不饱和度。
1H NMR数据显示存在五个烯烃质子：
δH7.01 (d, J = 8.3 Hz, H-12)
δH6.62 (q, J = 1.4 Hz, H-5)
δH6.41 (d, J = 8.3 Hz, H-13)
δH6.26 (dd, J = 17.6, 10.7 Hz, H-21)
δH5.34 (t, J = 7.2 Hz, H-16)
四个单峰甲基：
δH1.72 (s, H3-18)
δH1.71 (s, H3-19)
δH1.41 (s, H3-24)
δH1.34 (s, H3-23)
以及一个双峰甲基：
δH2.06 (d, J = 1.4 Hz, H3-25)
结合其13C NMR数据与HSQC谱图，共观察到27个碳信号，包括：
5个甲基
4个亚甲基（其中1个为烯烃亚甲基）
6个次甲基（5个为烯烃次甲基）
12个季碳
上述信息对应9个不饱和度，表明化合物1具有四环体系。
通过系统分析其二维核磁谱图（图2），确定了化合物1的平面结构。
图2. 化合物1的关键COSY与HMBC相关信号图
• 通过H-12/H-13的¹H-¹H COSY相关信号
• H-8与C-9/C-10/C-14、H-12与C-10/C-14、H-13与C-9/C-11的关键HMBC相关信号
• H₂-15/H-16的¹H-¹H COSY交叉峰
• H₂-15与C-10/C-11/C-12、H₃-18与C-16/C-17/C-19、H₃-19与C-16/C-17/C-18的HMBC相关信号
• H₂-1′与C-8的HMBC相关信号
• H₂-1′/H₂-2′的¹H-¹H COSY交叉峰
• C-1′ (δC41.0) 和C-2′ (δC 63.6) 的化学位移
• 片段I与片段II通过酰胺键连接：
- H-8与C-1 (δC167.5) 的HMBC相关信号
- 1634 cm⁻¹处的红外吸收峰
• α,β-不饱和酮结构单元（片段III）通过C-6−C-7键与片段I相连：
- H-5与C-3/C-6/C-7、H₃-25与C-3/C-4/C-5、H-8与C-6/C-7的HMBC相关信号
- C-7 (δC93.8) 的化学共振特征
• H-21/H₂-22的¹H-¹H COSY相关信号
• H-21与C-2/C-20/C-23/C-24、H₃-23与C-2/C-20/C-21/C-24、H₃-24与C-2/C-20/C-21/C-23的HMBC交叉峰
基于化合物1的13个不饱和度，最终确定片段IV通过C-2−C-7、C-2−C-1和C-2−C-3键分别与片段I、II和III连接，从而形成6/5/5/6环系平面结构。
采用ACD/Structure Elucidator软件对光谱数据进行更全面的结构表征分析。
经过修饰的分子连接图（MCD）（图S16）从429,734个异构体中，在8分钟内筛选出排名前8的候选结构。
我们推导的结构与排名第一（平均偏差最小）的结构完全一致：
神经网络方法计算得dN(¹³C+¹H)=2.855
dN(¹³C)=1.486（图S17）
图S16. 化合物1的分子连接图（MCD）
图S17. ACD/Structure Elucidator软件生成化合物1对应的结构列表
- 基于GIAO（规范不变原子轨道）方法的¹³C NMR计算结果：
实验与计算化学位移相关系数
表明理论计算与实验数据高度吻合
这一结果进一步验证了化合物结构的准确性，证明推导的分子结构与实验数据具有极好的一致性。
由于三个手性中心之间缺乏NOESY相关信号，对化合物1的四种可能相对构型进行了理论量子化学计算（图S3）：
1d (2R*,7S*,8R*)
计算结果表明：
异构体1a的¹H NMR和¹³C{¹H} NMR数据与实验值匹配度最高
两种核磁数据匹配度均达100%
因此确定其相对构型为1a
通过PBE0/def2-TZVP水平下化合物1 (2S,7R,8R) 的实验ECD谱与计算ECD谱比对：
最终确定其绝对构型为2S,7R,8R
为黄色油状物，经高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）分析确定其分子式为C28H31NO6（m/z 500.2059 [M + Na]+，C28H31NO6Na+理论计算值500.2049），对应14个不饱和度。
1H NMR、13C NMR及HSQC谱图显示存在28个碳信号，包括：
5个甲基
4个亚甲基
6个次甲基（其中5个为烯烃次甲基）
13个季碳（含1个酰胺羰基）
通过系统分析二维核磁谱图（图3）确认其平面结构。
图3. 化合物2的关键COSY与HMBC相关信号图
基于以下相关信号：
H-12/H-13和H2-20/H-21的¹H-¹H COSY相关信号
H-13与C-9/C-11/C-14、H2-20与C-10/C-11/C-12、H3-23与C-21/C-22/C-24、H3-24与C-21/C-22/C-23的HMBC交叉峰
证实C-11位连接有带异戊烯基的苯环结构（片段I）。
通过以下数据：
H2-1′/H2-2′/H-3′的¹H-¹H COSY相关信号
C-1′ (δC32.9) 和C-3′ (δC95.5) 的化学位移
鉴定了片段II的结构。
片段I与片段II的连接关系由以下信号确定：
H-3′与C-8/C-10的HMBC信号
H-1′与C-1/C-8的HMBC信号
通过以下相关信号：
H-5与C-3/C-6/C-7、H2-15与C-3、H3-25与C-3/C-4/C-5、H3-18与C-16/C-17/C-19、H3-19与C-16/C-17/C-18的HMBC相关信号
H2-15/H-16的¹H-¹H COSY相关
明确证实C-3位连接有带氧代异戊烯基的苯环结构，且C-4位连有甲基（片段III）。
值得注意的是，片段II与片段III的连接存在两种可能构型（2A和2B）（图S9）。
图S9. 化合物2A和2B的结构式
NMR计算与DP4+分析结果表明2A为正确结构（概率达99.99%），该结果亦通过ACD/Structure Elucidator计算验证，2A为最佳匹配结构（图S19）。
图S19. ACD/Structure Elucidator软件生成化合物2对应的结构列表
化合物2存在两个手性中心（C-3′和C-8），其间形成的氧桥结构使分子构型刚性固定，从而天然确定了C-3′与C-8的相对构型。
在三种理论水平（B972/def2TZVP、B972/pcsseg2和mPW1PW91/6−311+G**）下进行的13C NMR计算均证实其相对构型为3′R*,8R*（图S20）。
最终通过实验ECD谱与基于含时密度泛函理论（TD-DFT）的计算谱图对比，确定其绝对构型为3′R,8R（图S21）。
据我们所知，indopexine A (1) 和 B (2) 是首次报道的分别具有罕见6/5/5/6和6/5/6/6/6环系结构的异戊二烯基化异吲哚啉生物碱（PIDAs），其结构特征在于吲哚酮单元与芳香体系之间形成了独特的连接方式，这在已报道的骨架类型中极为罕见。
我们推导了化合物1和2的plausible生物合成途径，如下图所示：
两者的生物合成前体可追溯至已知化合物monodictyphenone
通过希夫碱反应生成中间体i
中间体ii通过酰胺缩合反应形成异吲哚啉结构单元
最终通过两条不同途径生成目标化合物：
路径A：ii经分子内环化和异戊烯化反应生成1b，脱水形成亚胺离子（1c），最终还原得到1
路径B：ii的C-3′位氧化生成2a，经异戊烯化和脱水反应得到2c，通过分子内缩醛化形成2d，最终环化生成2
通过LC-MS分析从曲霉TJ507的大米粗提物中直接检测到化合物1和2（图S41），证实其为天然产物。
化合物1对四种细胞系中的MDA-MB-231细胞表现出最显著抑制活性（表S24）：
Annexin V实验显示高剂量处理组的凋亡比例超过95%（图3A）
化合物1作用下细胞内ROS水平和caspase-3活性急剧升高，线粒体膜电位崩溃（图3B）
图3. (A) 化合物1诱导MDA-MB-231细胞凋亡。(B) MDA-MB-231细胞中活性氧（ROS）、半胱天冬酶-3（caspase-3）活性和线粒体膜电位（MMP）的流式细胞术分析。(C) eggNOG功能注释。(D) KEGG分析通路富集前25条通路。数据为三次实验的平均值±标准差（mean ± SD）。与对照组相比，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001。**
RNA测序分析鉴定出2737个上调基因和3396个下调基因（图S22A和B）：
信号转导机制是最主要的功能分类（图3C）
KEGG分析显示Rap1和PI3K/Akt信号通路显著富集（图3D）
GSEA证实化合物1显著抑制这两条通路（图S22C和D）
分子水平验证：
• qPCR显示化合物1以剂量依赖性方式抑制下游基因转录（图4A）
• Western blot证实Rap1、p-PI3K和p-Akt蛋白水平显著降低（图4B）
本研究从曲霉属真菌 Aspergillus sp. TJ507中成功分离获得两个结构新颖的异吲哚啉生物碱indopexine A (1) 和 B (2)。通过综合运用高分辨质谱（HRESIMS）、一维/二维核磁共振（¹H NMR、¹³C NMR、COSY、HSQC、HMBC）、计算机辅助结构解析（CASE算法）、量子化学计算（DP4+分析、GIAO-NMR计算）及电子圆二色谱（ECD）计算等手段，明确了它们的平面结构与绝对构型。化合物1具有前所未有的2-氧杂-10-氮杂四环[7.7.0.0¹,¹².0³,⁸]十六烷骨架（6/5/5/6环系），化合物2则展现出独特的5,20-二氧杂-1-氮杂五环[10.7.1.0¹,¹².0⁶,¹¹.0¹³,¹⁸]二十烷结构（6/5/6/6/6环系）。活性研究表明，化合物1能够通过调控Rap1/PI3K/Akt信号通路，诱导三阴性乳腺癌细胞线粒体依赖性凋亡。该工作不仅拓展了异吲哚啉生物碱的结构类型，也为开发针对三阴性乳腺癌的新型治疗策略提供了有价值的先导化合物和理论基础。