碧绿米仔兰中具缺血性脑卒中治疗潜力的特征性 Flavaglines 类化合物

表1. 碧绿米仔兰（A. perviridis）提取物及化合物对LPS诱导的BV-2小胶质细胞一氧化氮（NO）生成的抑制作用

通过检测一氧化氮生成量，并与模型组对比，评估了提取物的抗炎活性^[17]。在测试提取物中，碧绿米仔兰乙酸乙酯粗提物（APE）活性最显著，其IC₅₀值为3.20 ± 2.47 µg/mL（表1和图1）。

鉴于APE展现的良好体外活性，进一步研究了其在体内的药效。采用大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型评估APE对缺血性脑损伤的作用^[17]。在体内实验中，以100 mg/kg和200 mg/kg剂量给予APE。治疗组大鼠在实验期间体重未见明显变化。再灌注后24小时，MCAO/R模型组大鼠脑梗死体积显著增加，而APE（100和200 mg/kg）及丁苯酞（NBP，50 mg/kg）治疗可明显缩小脑梗死体积（图2A、B）。同时，MCAO模型大鼠脑含水量显著升高，而APE（100和200 mg/kg）及NBP（50 mg/kg）治疗后均能显著降低脑含水量（图2C）。这些结果共同表明，APE可发挥剂量依赖性的抗脑缺血保护作用。

图2. APE减轻MCAO/R模型大鼠的脑缺血损伤

为明确碧绿米仔兰（Aglaia perviridis）改善缺血性脑卒中作用的物质基础，对APE进行了系统的植物化学研究。分离鉴定出26个化合物，包括16个新化合物（1a、1b、2a、2b、3、4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a、8b、9）（图3）及10个已知化合物：环叶橄榄素（10）、大叶米仔兰素B（11）、橄榄素A（12）、去乙酰吡米米仔兰素C（13）、橄榄素B（14）、表银米仔兰醇（15）、银米仔兰醇（16）、吡米米仔兰碱（17）、4-羟基吡米米仔兰碱（18）和米仔兰碱（19）。

图3 化合物1−9的结构

化合物1的结构鉴定

化合物1为白色固体，其分子式经核磁图谱（表2、3）及HR-ESI-MS（m/z 671.2361 [M+Na]⁺，计算值671.2369）确认为C₃₈H₃₆N₂O₈，不饱和度为22。一维和二维核磁数据显示含有四个苯环信号，包括两个单取代苯环[δ_H7.75 (2H, m, H-20, H-24)，7.43 (2H, m, H-21, H-23)，7.49 (1H, m, H-22)；δ_C134.7 (C-19)，127.1×2 (C-20, C-24)，128.7×2 (C-21, C-23)，131.5 (C-22)；δ_H7.44 (2H, m, H-2″, H-6″)，7.21 (2H, m, H-3″, H-5″)，7.24 (1H, m, H-4″)；δ_C134.8 (C-1″)，128.7×2 (C-2″, C-6″)，125.3×2 (C-3″, C-5″)，128.8 (C-4″)]，一个1,4-二取代苯环[δ_H6.44 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2′, H-6′)，6.65 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3′, H-5′)；δ_C129.3 (C-1′)，128.7×2 (C-2′,C-6′)，114.4×2 (C-3′,C-5′)，159.1 (C-4′)]，以及一个1,2,3,5-四取代苯环[δ_H6.00 (1H, d, J=1.8 Hz, H-7)，6.28 (1H, d, J=1.8 Hz, H-9)；δ_C104.1 (C-5a)，159.7 (C-6)，93.8 (C-7)，170.0 (C-8)，89.0 (C-9)，173.7 (C-9a)]。核磁数据还显示存在1,4-丁二酰胺片段[δ_H3.61 (2H, m, H-13)，1.68 (2H, m, H-14)，1.60 (2H, m, H-15)，3.50 (1H, m, H-16)，3.41 (1H, m, H-16)，6.28 (1H, t, J=9.0 Hz, 17-NH)；δ_C38.7 (C-13)，25.4 (C-14)，26.4 (C-15)，39.6 (C-16)]和三个甲氧基[δ_H3.84 (3H, s, 6-OCH₃)，3.85 (3H, s, 8-OCH₃)，3.73 (3H, s, 4′-OCH₃)；δ_C56.2 (6-OCH₃)，56.3 (8-OCH₃)，55.4 (4′-OCH₃)]。这些信号解释16个不饱和度，余下2个不饱和度对应一个双环结构。

表2. 化合物1-9的核磁共振氢谱（600 MHz）数据

表3. 化合物1-7和9的13C核磁共振（150 MHz）数据

为进一步分析化合物1的二维核磁谱图，通过关键¹H‑¹H COSY相关信号（H-2′/H-3′、H-5′/H-6′）及HMBC相关峰（H-7与C-5/C-5a/C-6/C-8/C-9、H-9与C-5a/C-7/C-8/C-9a、H-2′/H-6′与C-2）确认了其黄酮片段（A部分）（图4）。¹H‑¹H COSY交叉峰（H₂-13/H₂-14/H₂-15/H₂-16）确定了1,4-丁二酰胺片段。关键¹H‑¹H COSY相关（H-2″/H-3″/H-4″/H-5″/H-6″和H-20/H-21/H-22/H-23/H-24）及HMBC相关（H-2″/6″与C-4、H-20/H-24与C-18）证明苯环分别连接于C-4和C-18位。通过HMBC相关（H-16a/H-16b/H-20/H-24与C-18、H₂-13与C-11、H-3与C-4/C-11）最终确定双酰胺片段（B部分）。甲氧基取代位置由HMBC相关（6-OCH₃与C-6、8-OCH₃与C-8、4′-OCH₃与C-4′）确认。

图4. 化合物1-9的关键HMBC与¹H-¹H COSY相关信号

核心双环结构由HMBC相关（H-3与C-4/C-5/C-10、H-2与C-4/C-11）及ACD/Structure Elucidator软件分析确定。将化合物1的分子式及一维、二维核磁原始数据输入ACD/Structure Elucidator软件^[24]，经修正分子连接图筛选出9个候选结构。软件采用三种方法（HOSE、神经网络和增量法，分别标记为dA、dN、dI）计算各候选结构的¹³C NMR化学位移，最终确定化合物1的平面结构如图1所示，其匹配因子较高（d_A=0.763；d_N=0.994；d_I=1.169）（图S1）。

图S1 CASE专家系统为化合物1生成的九种可能结构及其13C核磁化学位移预测偏差分析

采用三种预测方法对比实验与计算的13C NMR化学位移偏差：

dA(13C)：基于HOSE码方法的平均偏差

dN(13C)：基于人工神经网络预测方法的平均偏差

dI(13C)：基于增量预测方法的平均偏差

通过分析NOESY谱中的关键相关信号（H-2与H-2″/H-6″、H-3与H-2′/H-6′），初步确定化合物1的相对构型为2R和3R（图5）。然而，由于C-4位碳碳键的自由旋转，NOESY谱无法明确C-4位的构型。

图5. 化合物1、3、7的关键NOESY相关信号

为全面确定相对构型，采用GIAO方法在PCM/mPW1PW91/6-311+G(d,p)理论水平计算了两个可能异构体[2R,3R,4S* (1-1)和2R,3R,4R* (1-2)]的核磁化学位移。通过DP4+概率分析，结果表明化合物1的构型为2R,3R,4S*（概率98.7%）（图6A）。此外，化合物1无光学活性且无明显的Cotton效应，表明其为外消旋混合物。

图6. 化合物（A）1、（B）2、（C）4、（D）5 和（E）6 的线性回归与 DP4+ 分析

随后使用手性HPLC柱成功分离了对映体1a和1b（图S66），并通过ECD计算确定了其绝对构型（图7）。计算与实验ECD谱的对比分析显示：

• 1a：在220 nm和280 nm处呈现负Cotton效应，与计算的2R,3R,4S构型ECD谱高度吻合

• 1b：在相同波长处呈现正Cotton效应，对应2S,3S,4R构型

图7. 化合物1–8的计算与实验电子圆二色谱（ECD）图谱

最终确定：

• (−)-flavaperviridis A（1a）：绝对构型为2R,3R,4S

• (+)-flavaperviridis A（1b）：绝对构型为2S,3S,4R

这一结果通过比较实验与计算的ECD谱得到进一步验证（图7）。类似的方法也被用于确定化合物3、7和8的绝对构型，其ECD计算与实验数据也显示出良好的一致性（图7）。

化合物2为白色固体，其分子式经NMR及HR-ESI-MS数据（m/z 623.2764 [M+H]⁺，计算值623.2757）确定为C₃₇H₃₈N₂O₇，不饱和度为20。一维与二维核磁数据（表2、3）与已知化合物(±)-aglapernin^[16c]（一对Flavaglines对映体）类似，但C-3a（δ_C177.4）和C-8b（δ_C61.4）的化学位移与(±)-aglapernin（δ_C196.2, 94.3）显著不同，表明2可能为(±)-aglapernin的酮-酯重排产物。

HMBC相关（图4）信号（H-3与C-8a/C-8b/C-3a相关，H-2a/H-2b与C-8b相关）证实了C3a−C8b−C8a和C8b−C3的连接关系；H-2′/H-6′与C-8b的HMBC相关表明C-8b连接了一个1,4-二取代苯环。上述结果证实了酮-酯重排的推测，并得到ACD/Structure Elucidator软件CASE算法的验证，其匹配因子较高（dA=1.458；dN=1.122；dI=1.352）（图S2）。

图S2. CASE专家系统为化合物2生成的六种可能结构及其匹配因子分析

通过核磁位移计算结合DP4+概率分析，确定了C-8b和C-3的相对构型[3S,8bS(2-1) 和 3R,8bS(2-2)]，其中结构2-1的DP4+概率为100%（图6B），表明其为最可能构型。化合物2经手性柱分离得到一对对映体2a和2b（图S67），ECD计算确定其绝对构型分别为3R,8bR和3S,8bS（图7），分别命名为(−)-flavaperviridis B和(+)-flavaperviridis B。

化合物3为白色固体。根据HR-ESI-MS数据（m/z 592.2174 [M+CH₃OH−H₂O+H]⁺，计算值592.2183）及核磁谱图，确定其分子式为C₃₁H₃₁NO₁₀，不饱和度为17。一维与二维核磁数据（表2、表3）显示存在三个苯环信号：一个单取代苯环、一个1,4-二取代苯环和一个1,2,3,5-四取代苯环。此外，还存在三个甲氧基、三个亚甲基、两个次甲基及五个季碳信号。

关键的¹H-¹H COSY相关（图4）H-13a/H-13b/H-14/H-15及HMBC相关H-13a/H-13b与C-14/C-15、H₂-14/H₂-15/16-OCH₃与C-16共同构建了甲基丙烯酸4-氨基丁酯结构片段。HMBC相关中H-2′/H-6′与C-2、H-2″/H-6″与C-3的相关信号证实苯环分别连接于C-2与C-3位。

1,2,3,5-四取代苯环的连接通过HMBC相关进一步确认：H-7与C-5a/C-6/C-8/C-9相关，H-9与C-5a/C-7/C-9a相关，8-O₃与C-8相关。关键的¹H-¹H COSY相关H-3/H-4及HMBC相关H-3与C-5、H-4与C-2/C-5/C-11共同构成了苯并氧杂䓬骨架。

 通过ACD/Structure Elucidator软件CASE算法进行辅助解析，经修改的分子连接图（MCD）筛选生成22个候选结构，依据已知结构类比及较高的匹配因子（dA=3.129；dN=2.462；dI=2.488）（图S3），候选结构6被确定为最可能结构。

图S3. CASE专家系统为化合物3生成的可能结构及其匹配因子分析

化合物3的相对构型由关键的NOESY相关信号（图5）确定：H-2′/H-6′/H-4与H-3相关，推断为2R,3S,4S*构型。最终，通过实验与计算的ECD曲线比对（图7），确定其绝对构型为2R,3S,4S，命名为flavaperviridis C。

化合物4为白色固体。其分子式经HR-ESI-MS确定（m/z 673.2528 [M+Na]⁺，C₃₈H₃₈N₂O₈Na计算值673.2526）为C₃₈H₃₈N₂O₈，不饱和度为21。一维和二维核磁谱（表2、表3）显示四个苯环信号、一个1,4-丁二酰胺片段、三个甲氧基、一个次甲基及四个季碳。

特征¹³C NMR信号[δ_C101.1 (C-3a)和90.0 (C-8b)]及HMBC相关信号（H-3与C-2/C-3a/C-8b相关）（图4）表明化合物4属于环戊二烯并苯并呋喃类Flavaglines化合物。

HMBC谱中，H-2′/H-6′与C-3a的相关峰、H-2″/H-6″与C-3的相关峰及H-3与C-1′/C-11的相关峰证实苯环及1,4-丁二酰胺残基分别连接于C-3a、C-3和C-2位。C-1−C-2−C-11存在烯醇化1,3-二酮结构，其¹³C NMR值（δ_C206.8、101.1、168.2）及CDCl₃中测定¹H NMR谱观察到的酮-烯醇互变异构现象（图8）均支持该推论。

图8. 化合物4在CDCl₃和CD₃OD中测定的¹H NMR谱图对比

结合核磁计算与DP4+概率分析、生物合成途径、X射线晶体学数据及C-3a与C-3芳香环间的相互屏蔽效应导致的高场化学位移，确定C-8b位羟基、C-3a与C-3芳香环取代基均为β取向（图6C）。

外消旋混合物4经手性分离得到一对对映体4a和4b（图S68），经ECD计算确认其绝对构型分别为3R,3aR,8bS和3S,3aS,8bR（图7），分别命名为(-)-flavaperviridis D和(+)-flavaperviridis D。

化合物5和6具有相同的分子式C₃₈H₃₆N₂O₈，经HR-ESI-MS确证[m/z 649.2553 (5)和m/z 649.2547 (6) [M+H]⁺，C₃₈H₃₇N₂O₈计算值649.2550]，不饱和度为21，较化合物4少一个不饱和度。

5、6与4的核磁数据高度相似（表2、表3），表明它们具有与4相同的环戊二烯并苯并呋喃骨架，但C-2和C-3位取代基不同。

化合物5和6中α,β-不饱和酮结构可通过¹³C NMR中C-1/C-2/C-3的化学位移推断（5：δ_C200.7、131.8、171.9；6：δ_C199.7、143.6、152.3）。

关键HMBC相关信号（图4）显示，5中H-2″/H-6″与C-3相关，6中H-2″/H-6″与C-2相关，证实二者为C-2/C-3位取代的位置异构体。

类似地，C-3a和C-8b位的相对构型通过核磁计算结合DP4+概率分析、生物合成途径及X射线晶体学数据确定（图6D、E）。经手性色谱分离，成功将混合物拆分为两对对映体（5a与5b、6a与6b）（图S69、S70）。通过实验ECD谱与计算谱图对比分析，明确指认其绝对构型为(3aR,8bS)-5a、(3aS,8bR)-5b、(3aR,8bS)-6a和(3aS,8bR)-6b（图7），分别命名为(-)-flavaperviridis E、(+)-flavaperviridis E、(-)-flavaperviridis F和(+)-flavaperviridis F。

化合物7为白色粉末。经HR-ESI-MS [M+H]⁺离子峰m/z 651.2708（C₃₈H₃₉N₂O₈计算值651.2706）及核磁数据（表2、表3）确证其分子式为C₃₈H₃₈N₂O₈。

特征¹³C NMR信号[δ_C87.7 (C-2)和85.4 (C-5)]表明该化合物属于环戊二烯并苯并吡喃类Flavaglines。此外，谱图中还观察到δ_C90.2 (C-10)的含氧季碳信号及一组次甲基信号[δ_H4.11 (1H, d, J=4.2 Hz, H-3)和3.56 (1H, d, J=4.2 Hz, H-4)]。

这些数据提示化合物7与已知化合物环叶橄榄素（10）高度相似，但H-3与H-4的耦合常数不同，表明其为10的C-3差向异构体。这一推测进一步得到H-9/H-2′/H-6′的¹H NMR值支持[7中：δ_H6.37 (1H, d, J=1.8 Hz, H-9)，6.97 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2′, H-6′)；10中：δ_H5.46 (1H, d, J=2.4 Hz, H-2′, H-6′)，7.62 (2H, d, J=9.0 Hz, H-2′, H-6′)]，该变化源于C-3位苯环的屏蔽效应。

二维核磁数据进一步确证了化合物7的结构。7的旋光可忽略不计，表明其以外消旋混合物形式存在。经手性HPLC分离获得对映体7a和7b（图S71）。基于³J_3,4=4.2 Hz及NOESY谱推算的二面角∠H-3−C-3−C-4−H-4=46.6°，确定C-3C-4的相对构型为3S,4S。

通过实验与计算ECD谱图对比（图7），确定其绝对构型分别为2S,3R,4R,5S,10S和2R,3S,4S,5R,10R，并命名为(−)-flavaperviridis G和(+)-flavaperviridis G。

化合物8为白色粉末，经HR-ESI-MS中质子化分子离子峰m/z 651.2708 [M+H]⁺（C₃₈H₃₈N₂O₈计算值651.2706）及核磁数据确证其分子式为C₃₈H₃₈N₂O₈，对应不饱和度为21。

化合物8的核磁数据（表2、表4）显示黄酮及双酰胺片段的特征信号。通过H-3′″与C-3的显著HMBC相关（图4），最终确定了两片段间的连接，从而明确了其平面结构。

表4. 化合物8的¹³C NMR（150 MHz, CDCl₃）数据

经手性色谱分离得到一对对映体8a和8b（图S72）。通过实验与计算ECD谱图对比分析，确定其绝对构型分别为3′″R和3′″S（图7），并命名为(−)-flavaperviridis H和(+)-flavaperviridis H。

化合物9为无色粉末，经HR-ESI-MS检测到准分子离子峰m/z 339.1708 [M+H]⁺（C₂₀H₂₃N₂O₃计算值339.1709），确定分子式为C₂₀H₂₃N₂O₃。

一维核磁谱（表2、表3）显示：

• 一个单取代芳香环[δ_H7.80 (2H, 类d峰, J=8.4 Hz, H-3, H-7)，7.52 (1H, 类t峰, J=8.4 Hz, H-5)，7.45 (2H, 类t峰, J=8.4 Hz, H-4, H-6)；δ_C135.8 (C-2)，128.2 (C-3, C-7)，129.5 (C-4, C-6)，132.6 (C-5)]

• 一个1,3-二取代苯环[δ_H7.11 (1H, t, J=8.4 Hz, H-8″)，6.90 (1H, s, H-5″)，6.89 (1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-9″)，6.70 (1H, dd, J=8.4, 2.4 Hz, H-7″)；δ_C138.0 (C-4″)，116.7 (C-5″)，158.4 (C-6″)，116.5 (C-7″)，130.3 (C-8″)，121.5 (C-9″)]

• 一对顺式共轭双键[δ_H6.67 (1H, d, J=12.6 Hz, H-3″)，5.98 (1H, d, J=12.6 Hz, H-2″)；δ_C137.1 (C-3″)，125.0 (C-2″)]

• 一个1,4-丁二胺片段[δ_H3.37 (2H, t, J=6.6 Hz, H-2′)，3.25 (2H, t, J=6.6 Hz, H-3′)，1.57 (4H, m, H-4′, H-5′)；δ_C40.6 (C-2′)，27.5 (C-3′)，27.9 (C-4′)，40.1 (C-5′)]

基于以下关键相关信号确定其结构：

• ¹H-¹H COSY相关（图4）H-3/H-4/H-5/H-6/H7、H₂-2′/H₂-3′/H₂-4′/H₂-5′、H-/H-3″、H-7″/H-8″/H-9″

• HMBC相关（图4）H-3/H-7与C-1、H-3″与C-1″、H-5″/H-9″与C-3″相关

最终将其命名为aglaiabisadmie C。

化合物1和2代表了两类先前报道的结构骨架。基于其结构特征及前人研究^[24]，我们提出了这些化合物的可能生物合成途径。Flavaglines类化合物的基本骨架被认为是由黄酮母核与肉桂酸双酰胺片段通过[3+2]光环化，继而经酮醇重排及氧化反应形成。

对于化合物1，我们推测其源自苯并氧杂庚烯衍生物（b）。提出的生物合成途径始于水解反应，该反应裂解C-2与C-10间的碳-碳键，形成开环Flavaglines（c）；随后C-10位的羧基与NH-12位的氨基发生脱水缩合，生成中间体d；接着通过C-2位去羟基化和C-4位羟基化，促使4-OH与9a-OH位脱水基团缩合，最终形成化合物1（Scheme 1）。

Scheme 1. 化合物1的推测生物合成途径

化合物2被认为源自环戊二烯并苯并呋喃衍生物（h）。首先，C-1与C-8b间碳-碳键的氧化裂解导致C-8b形成酮羰基，C-1位羧基脱除，生成(±)-aglapernin；随后经酮-酯重排反应合成化合物2（Scheme 2）。

Sheme 2. 化合物2的推测生物合成途径

高效液相色谱（HPLC）以其快速分析、高灵敏度及优异分离效能，被用于碧绿米仔兰（A. perviridis）中多种粗提物及单体化合物的定性与定量分析。通过此分析方法，从19个色谱峰中成功鉴定出26个化合物，其中对映体因保留时间相同而呈现为单一色谱峰（图9）。这些化合物具有中等极性，在45%–60%乙腈范围内可被有效洗脱（图9）。

图9.（A）AP-1 和（B 与 C）APE 的 HPLC 特征分析

鉴定出的化合物包括22个Flavaglines类（1a、1b、2a、2b、3、4a、4b、5a、5b、6a、6b、7a、7b、8a、8b和10–16）及4个双酰胺类（9和17–19）（图9）。值得注意的是，作为生物合成前体的双酰胺类化合物含量普遍较高（图9）。这些发现为后续开展碧绿米仔兰的分离制备、结构鉴定及体内代谢研究奠定了基础。

为进一步探究此类物质是否可通过非酶促反应自发形成，我们选择5,7,4′-三甲氧基山奈酚和pyramidatine分别作为黄酮与双酰胺的代表性化合物进行分析。将两种化合物按1:1混合并溶于甲醇后，分别在以下氧化条件下处理：

• （a）室温避光

• （b）室温自然光

• （c）100°C避光

• （d）100°C光照

各条件处理12小时后，采用一致色谱参数分析。结果显示反应后原料的吸收值与保留时间均未改变，且未检测到新吸收峰。基于上述观察，我们推断这些化合物在非酶促条件下难以自发形成，其可能形成需外加催化剂参与（图10）。

图10. 非酶促反应产物的HPLC分析

采用LPS诱导的BV-2小胶质细胞模型，以一氧化氮释放为主要评价指标，评估了化合物1–19的抗炎活性^[17]。测试化合物中，5和6表现出显著强于阳性对照米诺环素（Mino）（IC₅₀=24.90 ± 1.34 μM）的抗神经炎症活性（IC₅₀分别为11.21 ± 3.46 μM和2.04 ± 1.10 μM）（表1与图1）。

为阐明碧绿米仔兰（A. perviridis）治疗缺血性脑卒中的药效物质基础及可能机制，本研究对多种粗提物进行了系统的体外活性筛选。体外活性结果显示，碧绿米仔兰乙酸乙酯提取物（APE）表现出显著的抗神经炎症活性。随后的体内实验表明，APE可显著缩小MCAO/R模型大鼠的脑梗死体积，并有效减轻脑水肿。上述结果表明，APE是碧绿米仔兰发挥抗缺血性脑卒中作用的主要活性部位。

为明确其活性成分，我们对APE进行了系统的植物化学研究，分离鉴定出26个化合物，包括16个首次报道的新化合物，分别命名为flavaperviridises A–H（对应1–8）和aglaiabisadmie C（9）。其中，化合物1和2具有不同于经典黄酮结构的新颖骨架特征。通过HPLC对这些Flavaglines类成分进行表征，为后续该类化合物的分离、结构鉴定及体内代谢研究提供了基础。

分离得到的化合物在LPS诱导的小胶质细胞模型中进行活性评价，仅化合物5和6表现出较阳性对照更显著的抗炎活性。这一现象提示，APE的抗神经炎症作用可能是多种Flavaglines类成分协同作用的结果，而非单一化合物活性所致。本研究首次从物质基础上验证了米仔兰属植物传统抗炎应用的科学性，并凸显了Flavaglines类化合物作为缺血性脑卒中治疗先导物的潜力。