Lagarocladone A：纤枝金丝桃中前所未有的多环多异戊烯基酰基间苯三酚
摘要
从纤枝金丝桃（Hypericum lagarocladum）地上部分分离出两个新的多环多异戊烯基酰基间苯三酚（PPAP）类化合物 Lagarocladone A (1) 和 Lagarocladone B (2)，以及三个已知类似物。其中，1 的结构尤其独特，具备前所未有的 6/6/5/5/6/5 环系，其核心骨架被鉴定为螺[2-氧杂-二环[4.3.0]壬烷-4,6′-四环[10.4.0.0³,¹⁰.0⁴,⁸]十六烷]。该结构被确认为首个 1,2/13,14-双裂环螺环 PPAP 衍生物。
通过综合光谱数据、计算机辅助结构解析、量子 ¹³C NMR DP4+ 分析及电子圆二色谱计算，明确了其相对与绝对构型。此外，在体外肝细胞损伤模型中，1 表现出显著的对乙酰氨基酚诱导细胞毒性的肝保护活性，其机制与减轻氧化应激和维持细胞膜完整性相关。
本研究不仅扩展了 PPAP 类天然产物的结构多样性，也为其潜在的药物开发价值提供了线索。
引言
多环多异戊烯基酰基间苯三酚（Polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols, PPAPs）是藤黄科（特别是金丝桃属）植物的标志性次生代谢产物，以其高度复杂、多变且通常具有显著生物活性的骨架结构，在天然产物化学和药物发现领域备受关注。迄今为止，已从该属植物中分离鉴定出超过 900 个 PPAPs 类化合物。
根据核心骨架的差异，PPAPs 主要分为三类：双环 PPAPs、笼状 PPAPs（具有金刚烷或同金刚烷骨架）以及螺环 PPAPs（以螺[环己烷-1,5'-茚]八氢结构为核心）。在此基础上，一些由已知骨架经氧化断裂等生源转化衍生而来的复杂结构被归类为裂环螺环 PPAPs，代表了该类化合物结构演化的一个分支。
图1. 具有不同裂环螺环骨架的典型螺环PPAP型天然产物及其假定的生源关系
纤枝金丝桃（Hypericum lagarocladum）是金丝桃属的一员，主要分布于中国西南部。前期研究表明，该植物富含结构多样的 PPAPs 类成分，是发现新结构和新活性的重要资源。
在本课题组持续的系统性筛选研究中，我们对该植物的地上部分进行了系统的化学成分分离。在此，我们报道从中分离得到的五个 PPAPs 类化合物（1–5），并重点阐述其中两个新化合物 Lagarocladone A (1) 和 B (2) 的结构解析过程。
Chart 1. 化合物1-5的化学结构式
尤其值得注意的是，Lagarocladone A (1) 展现了一个前所未有的高度重排骨架，被鉴定为第一个 1,2/13,14-双裂环螺环 PPAP 衍生物。本文不仅报道了其分离、结构鉴定（包括构型确定）的完整过程，还探讨了其合理的生源合成途径，并评估了其潜在的肝保护活性，以期为理解 PPAPs 的结构多样性与生物功能提供新的见解。
结果与讨论
通过系统的柱层析分离与纯化，从纤枝金丝桃的乙醇提取物中分离得到两个新化合物 Lagarocladone A (1) 和 Lagarocladone B (2)，以及三个已知化合物 Hyperacmotone D (3)、Sampsonol B (4) 和 Hyperacmotone E (5)。已知化合物的结构通过对比已报道的核磁共振（NMR）和质谱数据得到确认。
2. Lagarocladone A (1) 的结构解析
2.1 平面结构的确定
Lagarocladone A (1) 为无色粘稠油状物。高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）给出其分子离子峰 [M + H]⁺ 为 m/z 565.2798（计算值 C₃₃H₄₁O₈⁺， 565.2795），确定其分子式为 C₃₃H₄₀O₈，不饱和度为 14。
¹H NMR 谱图显示一组邻位取代苯环的信号 [δH 8.07 (dd, J = 8.0, 1.1 Hz), 7.60 (td, J = 8.0, 1.1 Hz), 7.48 (d, J = 8.0 Hz), 7.36 (t, J = 8.0 Hz)]，两个含氧次甲基质子信号 [δH 3.48 (d, J = 2.4 Hz), 3.11 (d, J = 2.4 Hz)]，以及六个甲基单峰信号。
¹³C NMR 和 DEPT-135 谱共显示 33 个碳信号，包括四个羰基碳（δC ~200, 177, 172），六个芳香碳，六个甲基碳，五个亚甲基碳，六个次甲基碳和六个季碳。初步数据暗示 1 是一个结构复杂的 PPAP 衍生物。
Table 1. 1 H (600 Hz) and 13C{1 H} NMR (150 Hz) of 1
为了阐明其复杂的平面结构，我们综合运用了包括 ¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC 在内的二维核磁共振技术。分析步骤如下：
通过 ¹H-¹H COSY 和 HSQC 谱，识别出四个相互连接的结构单元（片段 I–IV）。
关键性的 HMBC 远程相关信号将这些片段连接起来，构筑出完整的环系：
A/B 环：由 HMBC 中 H-29→C-27、H-32→C-24、H₃-25→C-33、H₃-26→C-23 等信号，证实其为 4,4-二甲基-3,4-二氢萘-1(2H)-酮 单元。
C/D 环：H₂-22 与 C-6/C-4、H₂-14 与 C-6/C-1/C-2/C-4/C-5 的 HMBC 相关，结合 C-6 的低场位移 (δC 75.4)，确定其为两个稠合的五元环，且 C-6 位连有羟基。
E/F 环：H-7→C-2/C-3/C-9、H-8→C-10/C-13、H-12→C-9 等 HMBC 信号，结合 C-9 的酮羰基特征位移，证实其为 5-乙酰基-7a-甲基六氢环戊烷并[b]吡喃-2(3H)-酮 单元。
HMBC 谱中 H₂-7 与 C-2/C-3/C-4/C-14 以及 H₂-14 与 C-2/C-3/C-4/C-7 的相关，揭示 D 环和 E 环通过 C-3 形成一个关键的螺环连接。此外，通过 H₂-22→C-17/C-5、H-17→C-4/C-5 等信号，以及 H-17 与 H-18 之间 2.4 Hz 的特征耦合常数，确定了 C-5 位连接着一个具有 17R,18S-反式环氧丙烷 结构的氧化异戊烯基侧链。
图2. 化合物1的关键二维核磁（2D NMR）相关信号图示
基于以上分析，1 的平面结构得以明确，其前所未有的 6/6/5/5/6/5 环系可被系统命名为螺[2-氧杂-二环[4.3.0]壬烷-4,6′-四环[10.4.0.0³,¹⁰.0⁴,⁸]十六烷] 骨架。
2.2 计算机辅助结构验证
由于未能获得适合 X-射线衍射的单晶，我们采用 ACD/Structure Elucidator Suite 2020.1.1 软件对推导出的平面结构进行验证。
将分子式及一维、二维 NMR 数据输入软件后，其模糊结构生成算法共产生了 18,909 个候选结构。经神经网络法和增量法进行 ¹³C NMR 化学位移预测与排序，手动推导出的结构在所有候选结构中排名第一，其预测值与实验值的线性相关系数高达 0.9991（神经网络法）和 0.9988（增量法），平均偏差均小于 1.85 ppm。
图3. 化合物1的CASE分析：MCD、前5名候选结构，以及实验值与ACD软件预测的¹³C NMR化学位移间的线性相关性
这一结果从计算角度有力支持了所提出平面结构的正确性。
2.3 相对构型的确定
化合物 1 的相对构型通过综合分析 NOESY 谱中的关键空间相关、特征耦合常数以及 DFT 计算辅助的 DP4+ 概率分析来确定。
H-1 与 H-23 之间的大耦合常数 (³JH‑1/H‑23 = 14.3 Hz) 及相应的 NOE 相关，表明 B 环与 C 环为反式稠合。
H-1 与 H-17 的 NOE 相关表明 C-5 位侧链与 H-1 同处 α-侧。结合 H-14b 与 H-23 的 NOE 相关，推断了 6-OH 为 α-构型，从而确认 C 环与 D 环为顺式稠合。
H3-16 与 H-8、H-10b 的强 NOE 相关，以及 H-12 与 H-10a 的相关，确定了该片段中 H3-16、H-8 和 C12–C13 键共面并处于 β-取向。
关键的 NOE 相关（H-7a/H-14a, H-7a/H-12, H-7b/H-14a, H-7b/H-12）只有在碳链 C14–C3–C7–C8–C12 呈平面构型且螺中心 C-3 为 R 构型时才得以解释。
H-17 与 H-18 之间 2.4 Hz 的耦合常数表明其为反式构型。进一步的 DFT ¹³C NMR 计算及 DP4+ 分析（在氯仿和甲醇溶剂模型中，1a 构型的匹配概率均 >99.9%）最终将环氧丙烷部分的相对构型指定为 17R,18S。
相对构型结论：综上，化合物 1 的相对构型被确定为1R*, 3R*, 5R*, 6S*, 8S*, 9R*, 12R*, 17R*, 18S*, and 23S*。
2.4 绝对构型的确定
通过含时密度泛函理论（TDDFT）计算化合物 1 及其对映异构体的电子圆二色谱（ECD），并将计算曲线与实验谱图进行比较。
结果显示，计算得到的 1R,3R,5R,6S,8S,9R,12R,17R,18S,23S 构型的 ECD 曲线与实验数据高度吻合（图 4），从而确定了 1 的绝对构型。
图4. (A–D) 化合物1a和1b的实验与计算¹³C NMR化学位移之间的线性相关性及DP4+概率分析；(E, F) 化合物1–2的实验与计算ECD谱图；(G, H) 化合物2–5的实验ECD谱图
Lagarocladone B (2) 以无色胶状物形式分离得到。高分辨电喷雾电离质谱 (HR-ESI-MS) 确定其分子式为 C₃₃H₄₂O₇（[M + H]⁺ m/z 551.2996，计算值 551.3004），对应 13 个不饱和度。
对比化合物 2 与 hyperacmotone D (3) 的核磁共振数据（图S42 和图S43，表S2）显示，C-1 的化学位移向低场移动，而 C-3/5/7 的化学位移向高场移动，表明 C-3 位发生了构型翻转。这一点通过对比化合物 2–5 的圆二色谱 (CD) 得到了进一步佐证（图4）。
通过将实验ECD谱与计算曲线进行比较，确定了化合物 2 的绝对构型，其结构最终得以确立，如Chart 1 所示。
除化合物 1 和 2 外，本研究中还分离得到了已知化合物 hyperacmotone D (3)、sampsonol B (4) 和 hyperacmotone E (5)。通过将其核磁共振和质谱数据与文献报道的数据进行比较，确认了它们的结构。
4. Lagarocladone A (1) 的生源途径探讨
为阐释 Lagarocladone A (1) 异常复杂骨架的起源，我们提出了一个合理的生源合成假设（Scheme 1）。
Scheme 1. 化合物1的合理生源合成途径
该途径以常见的螺环 PPAP Hyperacmotone D (3) 为起点，通过一系列连续的氧化、开环、键的断裂与重组（包括逆克莱森缩合、自由基环化及关键的帕特诺-比希反应），逐步构建了其独特的双裂环螺环骨架。
这一假设不仅为 1 的结构提供了生源逻辑，也揭示了 PPAPs 类化合物在植物体内可能经历的复杂重排过程，丰富了该类天然产物的生源理论。
5. 生物活性评估：对乙酰氨基酚诱导肝细胞损伤的保护作用
鉴于 PPAPs 类化合物常具有多样的生物活性，我们评估了化合物 1–5 在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的 HepG2 肝细胞损伤模型中的保护作用。
CCK-8 法显示，在最高测试浓度（50 μM）下，所有化合物对 HepG2 细胞均无显著毒性。
在 APAP 损伤模型中，Lagarocladone A (1) 在 12.5–50 μM 浓度范围内表现出剂量依赖性的显著保护作用，能有效提高受损细胞的存活率。
图6. 化合物1对APAP诱导HepG2细胞损伤的保护作用
(A) 先用化合物1（1.5625–50 μM）或N-乙酰半胱氨酸（NAC, 2.5 mM）预处理24小时，再用15 mmol/L APAP处理24小时后的细胞活力。
(B) 化合物1预处理减弱APAP诱导的HepG2细胞ROS产生。
(C) 化合物1预处理对细胞培养基中ALT释放的影响。
(D) 化合物1预处理对细胞培养基中AST释放的影响。
数据以均值±标准差表示（n = 3）。####P < 0.0001 与对照组比较；P < 0.01，P < 0.001，***P < 0.0001 与APAP组比较（ns，无显著性差异）。
为探究其保护机制，我们检测了相关指标：
氧化应激：DCFH-DA 荧光探针检测表明，1 预处理能显著降低 APAP 引起的细胞内活性氧（ROS）水平升高。
细胞膜完整性：APAP 暴露导致肝损伤标志物天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）释放显著增加，而 1 的预处理能有效抑制这种泄漏，其效果与阳性对照药物 N-乙酰半胱氨酸（NAC）相当。
这些结果表明，Lagarocladone A (1) 的肝保护作用可能主要通过减轻氧化应激和维持肝细胞膜完整性来实现。
结论
本研究从纤枝金丝桃中成功分离并鉴定了两个新的 PPAP 类化合物 Lagarocladone A (1) 和 B (2)。其中，Lagarocladone A (1) 的结构尤为引人注目，其前所未有的 6/6/5/5/6/5 环系代表了首个 1,2/13,14-双裂环螺环 PPAP 骨架类型，显著拓展了 PPAPs 的结构多样性边界。
通过综合运用现代波谱学、计算机辅助解析(CASE)和量子化学计算，我们完整阐明了其复杂的平面与立体结构。提出的生源途径为理解此类高度重排骨架的形成提供了合理假设。
更重要的是，初步的体外活性研究表明，Lagarocladone A (1) 具有显著的抗 APAP 诱导肝细胞损伤的活性，提示其作为肝保护先导化合物的潜在价值。
本研究不仅为金丝桃属植物的化学研究增添了新成员，也为基于天然产物的肝病药物发现提供了新的结构模板和活性线索。后续研究将围绕其深入的构效关系、体内药效及具体分子作用机制展开。