(±)-Odoriferols A–E：降香黄檀中五对对映异构体的分离与结构鉴定
摘要
从豆科植物降香黄檀（Dalbergia odorifera）心材的甲醇提取物中，分离得到12个新化合物，包括五对对映异构的苯并呋喃及黄酮衍生物（1–5），一个苯并呋喃类化合物（6）和一个三萜类化合物（7）。
通过综合光谱分析（UV、IR、HR-ESI-MS、1D和2D NMR），结合ACD/Structure Elucidator 计算机辅助结构解析及计算核磁共振（NMR）和电子圆二色谱（ECD）比对，阐明了其平面结构和绝对构型。
结构上，化合物1具有独特的螺[4.4]骨架；化合物2含有罕见的6/5/5三环系统，包含一个1-甲基-2,7-二氧杂双环[3.2.1]辛烷-6-酮结构单元。本研究并提出了化合物1与2的合理生源合成途径。
活性评价显示，七个化合物（1a、2a、2b、4a、4b、6和7）在脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7模型中，对一氧化氮（NO）的产生具有显著抑制活性，半数抑制浓度（IC₅₀）在6.3至19.9 μM之间。其中，三萜类化合物7活性最佳，IC₅₀为6.3 μM。黄檀属（Dalbergia）植物涵盖乔木与灌木，广泛分布于南美洲、非洲及亚洲热带、亚热带地区。该属约有120个物种，其中约28种为中国原产。多种黄檀属植物在传统医学中具有重要应用：降香黄檀在中国民间医学中用于治疗心脑血管疾病；D. tsoi 曾用于伤口愈合；而印度黄檀（D. sissoo）则在当地部落中被用于治疗多种癌症。
系统的植物化学研究表明，该属植物富含结构多样的次级代谢产物，主要包括黄酮类、苯并呋喃类、倍半萜类、蒽醌类及甾体类化合物。这些成分展现出广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗真菌、抗心肌缺血及促成骨作用。
降香黄檀是黄檀属中的代表性药用植物，以其"活血化瘀"功效著称。其主要分布于中国海南省，其心材质地坚硬、纹理美观且香气独特，是高档家具与工艺雕刻的珍稀原料。此前对该物种的化学成分研究表明，其心材主要含有倍半萜、黄酮类（如异黄酮、查耳酮）、苯并呋喃类、醌类及脂肪酸等。
其中部分化合物显示出显著的抗炎活性：例如，苯并呋喃衍生物美迪紫檀素（medicarpin）能显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞中NO的生成；新黄酮类化合物黄檀内酯（dalbergiphenol）通过抑制白细胞介素-6和白细胞介素-8的分泌以缓解皮肤炎症；而其标志性成分紫檀素（pterocarpin）同样具有抑制NO产生的活性。
作为我们从黄檀属植物中持续寻找天然抗炎先导化合物研究的一部分，本研究对降香黄檀心材进行了系统的化学分离，共获得12个新化合物，包括五对对映异构体（1–5）、一个苯并呋喃（6）及一个三萜（7）（图1）。本文详细报道了这些化合物的分离纯化、结构鉴定、绝对构型确定以及体外抗炎活性评价结果。
(±)-Odoriferol A (1) 为黄色油状物。其高分辨电喷雾电离质谱（(+)-HR-ESI-MS）显示准分子离子峰 m/z 301.0705 [M+H]⁺（计算值 C₁₆H₁₃O₆⁺， 301.0707），确定分子式为 C₁₆H₁₂O₆，不饱和度为11。
红外光谱显示羟基（3425 cm⁻¹）和羰基（1738 cm⁻¹）的特征吸收。¹H NMR数据（表1）揭示两组ABX耦合的芳香质子信号［δH 7.71 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-4), 6.87 (1H, dd, J = 8.7, 2.2 Hz, H-5), 6.77 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-7)；以及 δH 7.04 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-3′), 6.61 (1H, dd, J = 8.7, 2.5 Hz, H-4′), 6.81 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6′)］，并包含两个甲氧基信号［δH 4.00 (3H, s, 6-OCH₃), 3.80 (3H, s, 5′-OCH₃)］。
表1. 化合物1–6的¹H NMR数据（600 MHz，δ (ppm)，J (Hz)）
¹³C NMR及DEPT谱（表2）共显示16个碳信号，包括两个甲氧基碳［δC 57.1 (6-OCH₃), 56.4 (5′-OCH₃)］、六个芳香次甲基碳［δC 127.7 (C-4), 113.9 (C-5), 97.8 (C-7), 98.3 (C-6′), 107.7 (C-5′), 109.8 (C-3′)］及八个季碳［δC 121.7 (C-2), 185.6 (C-3), 110.9 (C-9), 171.3 (C-6), 171.9 (C-8), 140.0 (C-2′), 146.8 (C-1′), 157.3 (C-5′)］。
HMBC谱中的关键相关（图2）为结构解析提供了关键依据：第一组芳环中，H-4与C-3、C-6、C-8和C-9相关；H-7与C-6、C-8和C-9相关；6-OCH₃质子与C-6相关。第二组芳环中，H-6′与C-1′、C-2′和C-5′相关；H-3′与C-1′、C-2′、C-4′和C-5′相关；5′-OCH₃质子与C-5′相关。
值得注意的是，位于δC 121.7的季碳（C-2）在HMBC谱中未观察到任何C–H相关，由此初步确立了一个2-苯基苯乙酮骨架。已识别官能团解释了11个不饱和度中的10个，暗示存在一个额外环。结合季碳C-2的连接性，推断该环系由C-2作为螺原子，桥连一个苯环与一个苯并呋喃-3-酮单元而形成。
表2. 化合物1–6的¹³C NMR数据（150 MHz，δ (ppm)）
图2. 化合物1–6的关键HMBC（H→C）、¹H-¹H COSY（─）与¹H-¹H NOESY（↔）相关
由于未能获得化合物1的单晶，无法通过X射线衍射确定其绝对构型。为验证所提出的平面结构，将其质谱与核磁数据导入ACD/Structure Elucidator Suite进行计算机辅助结构解析。
软件基于分子连接图生成了14个候选结构，经筛选后获得排名前六的结构（图3）。其中排名第一的结构（ID = 1）具有最低的综合标准偏差，且其DP4+概率分析结果显示：基于HOSE算法的¹³C NMR数据偏差dA(¹³C)为3.140，概率DP4A(¹³C)为100.00%；基于神经网络算法的偏差dN(¹³C)为1.806，概率DP4N(¹³C)为100.00%；基于增量法的偏差dI(¹³C)为1.947。
这些数据一致支持该结构为化合物1的最佳匹配结构，与初步结构解析结果相符。计算与实验¹³C NMR化学位移的高度吻合进一步证实了结构的准确性。
综上，化合物1被鉴定为(±)-5′,6-二甲氧基-3H-螺[苯并呋喃-2,2′-苯并[d][1,3]二氧戊环]-3-酮，命名为(±)-odoriferol A。
图3. ACD/Structure Elucidator Suite生成的候选结构排名
¹H NMR显示一组单取代苯环信号［δH 7.74 (2H, m, H-2′,6′), 7.45 (2H, t, J = 8.1 Hz, H-3′,5′), 7.42 (1H, m, H-4′)］、两个孤立芳氢信号［δH 6.34 (1H, s, H-6), 6.50 (1H, s, H-9)］、一个亚甲基［δH 2.61 (1H, d, J = 11.5 Hz, Ha-2a), 2.66 (1H, d, J = 11.5 Hz, Hb-2a)］、一个甲基［δH 1.89 (3H, s, 2-CH₃)］、一个甲氧基［δH 3.84 (3H, s, 8-OCH₃)］及一个可交换的羟基质子［δH 5.22 (1H, s, 7-OH)］。
¹³C NMR与HSQC谱共归属了18个碳信号，包括五个含氧季碳［δC 103.7 (C-2), 172.6 (C-4), 140.7 (C-7), 147.7 (C-8), 144.9 (C-10)］、三个季碳［δC 50.2 (C-5), 116.7 (C-11), 134.8 (C-1′)］、七个芳香次甲基碳［δC 112.2 (C-6), 100.2 (C-9), 128.2 (C-2′,6′), 128.8 (C-3′,5′), 128.2 (C-4′)］、一个亚甲基碳［δC 41.9 (C-2a)］、一个甲基碳［δC 23.4 (2-CH₃)］及一个甲氧基碳［δC 56.2 (8-OCH₃)］。
关键HMBC相关如下：2-CH₃与C-2和C-2a相关；亚甲基质子H-2a与2-CH₃、C-2、C-4、C-5、C-11及C-1′相关；7-OH与C-6、C-7、C-8相关；芳氢H-6和H-9与C-5、C-7、C-8、C-10相关；苯环质子H-3′,5′与C-1′相关；8-OCH₃与C-8相关。
基于上述数据，化合物2被鉴定为一个结构新颖的苯并二氧杂䓬类衍生物，命名为(±)-7-羟基-8-甲氧基-2-甲基-5-苯基-2,5-甲烷-1,3-苯并二氧杂䓬-4(5H)-酮，即(±)-odoriferol B。
其¹H与¹³C NMR数据呈现两组ABX耦合芳香系统特征［δH 7.54 (1H, d, J = 9.1 Hz, H-4), 6.62 (1H, dd, J = 9.1, 2.1 Hz, H-5), 6.42 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-7)；以及 δH 6.62 (1H, d, J = 2.6 Hz, H-3′), 6.47 (1H, dd, J = 8.7, 2.6 Hz, H-5′), 7.40 (1H, d, J = 8.7 Hz, H-6′)］。
谱图中还包含一个羟基［δH 9.07 (1H, s, 2′-OH)］、一个酮羰基碳［δC 202.5 (C-3)］、一个甲基［δC 22.3 (2-CH₃)］及两个甲氧基［δC 61.2 (6-OCH₃), 56.0 (4′-OCH₃)］。
HMBC谱中的关键相关确定了其平面结构：2-CH₃与C-2、C-3及C-1′相关；2′-OH与C-1′、C-2′和C-3′相关；H-4与C-3、C-6和C-8相关；H-6′与C-2、C-2′和C-4′相关。
因此，化合物3被鉴定为(±)-2-(2′-羟基-4′-甲氧基苯基)-6-甲氧基-2-甲基苯并呋喃-3(2H)-酮，命名为(±)-odoriferol C，属于C-2位甲基取代的苯并呋喃-3-酮衍生物。
其一维NMR谱与二氢异黄酮骨架特征高度吻合，其C环的C-2（δC 75.2）和C-3（δC 75.0）化学位移表明C-3位存在含氧取代。
HMBC相关显示：H-5与C-4、C-7、C-9相关；H-6′与C-3、C-2′、C-4′相关；H-2与C-4、C-9、C-1′相关；3-OH与C-3相关。
这些数据确证化合物4为一个二氢异黄酮衍生物，在C-7、C-2′和C-4′位各有一个甲氧基取代，且在C-3位有一个羟基。因此，化合物4被鉴定为(±)-3-羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷酮，命名为(±)-odoriferol D。
其¹H和¹³C NMR数据显示四个甲氧基信号［δH 3.89 (3H, s, 7-OCH₃), 3.79 (3H, s, 2′-OCH₃), 3.80 (3H, s, 3′-OCH₃), 3.84 (3H, s, 4′-OCH₃)］，以及二氢异黄酮C环的特征信号［δH 4.61 (1H, dd, J = 11.8, 11.0 Hz, Ha-2), 4.50 (1H, dd, J = 11.0, 5.6 Hz, Hb-2), 4.17 (1H, dd, J = 11.8, 5.6 Hz, H-3)；δC 72.1 (C-2), 49.0 (C-3)］。
HMBC谱中的关键相关进一步支持了该结构：Ha-2和Hb-2与C-3、C-4、C-9相关；H-3与C-2、C-3、C-1′相关；H-5与C-4、C-7、C-9相关；H-6与C-8、C-10相关；H-5′与C-1′、C-3′相关；H-6′与C-2′、C-4′、C-5′相关。
因此，化合物5被鉴定为在C-7、C-2′、C-3′和C-4′位带有甲氧基取代的二氢异黄酮，即(±)-2′,3′,4′,7-四甲氧基异黄烷酮，命名为(±)-odoriferol E。
(±)-Odoriferols A–E (1–5) 在旋光仪上均未显示光学活性，表明它们以外消旋混合物形式存在。通过半制备手性高效液相色谱（HPLC）成功拆分这些外消旋体，得到相应的对映异构体。各对映体呈现镜像对称的圆二色谱（CD）曲线，证实了其对映关系。
随后，采用含时密度泛函理论（TDDFT）在甲醇溶剂（IEFPCM模型）中，于B3LYP/6-31G*//Cam-B3LYP/DGDZVP理论水平下进行了电子圆二色谱（ECD）计算。通过对比计算与实验ECD谱图（图4），绝对构型得以确定：
化合物1a和3a被指定为2R构型，1b和3b为2S构型；化合物4a和5a为3R构型，4b和5b为3S构型。由于化合物2的桥环骨架具有刚性，其C-2和C-5位手性中心的构型呈协同性：化合物2a被指定为2R,5R构型，2b为2S,5S构型。
对¹H和¹³C NMR谱的详细分析表明，化合物6具有经典的2-苯基苯并呋喃骨架。¹H NMR谱显示三个甲氧基信号［δH 4.30 (3H, s, 7-OCH₃), 3.97 (3H, s, 3′-OCH₃), 3.92 (3H, s, 4′-OCH₃)］。
HMBC谱中，这些甲氧基质子分别与δC 131.5 (C-7)、135.8 (C-3′)和152.1 (C-4′)的碳信号相关。此外，δH 6.87 (H-5)与δC 125.3 (C-9)、131.6 (C-7)及144.6 (C-6)的相关，结合C-7的特征化学位移，确证了C-7位甲氧基的取代。
关于2-苯基部分，δH 6.60 (H-5′)和7.61 (H-6′)与δC 152.1 (C-4′)的相关，以及H-5′与δC 135.8 (C-3′)的相关，确认了C-3′和C-4′位的甲氧基取代。C-6（δC 146.6）和C-2′（δC 146.6）的化学位移则提示这两个位置为羟基取代。
NOESY谱中观察到的4′-OCH₃与H-5′的相关，以及δH 6.50 (2′-OH)与3′-OCH₃的相关，进一步支持了C-2′位为羟基、C-3′和C-4′位为甲氧基的归属。
因此，化合物6的结构确定为2-(2′-羟基-3′,4′-二甲氧基苯基)-6-羟基-7-甲氧基苯并呋喃，命名为odoriferol F。
详细的¹H和¹³C NMR分析表明，化合物7的平面结构与已知化合物11α,12α-环氧-3β,4β-二羟基-24-去甲齐墩果-28-酸高度相似。基于全面的二维NMR数据，主要区别在于化合物7的C-13位存在一个额外的羟基。
对于齐墩果烷型三萜，其C-5、C-8、C-9、C-10、C-14和C-17位的构型通常是固定的。NOESY谱显示δH 3.01 (H-11)与δH 1.06 (H-26)存在相关。由于桥环体系的刚性，H-11和δH 3.03 (H-12)在双环骨架上预计采取赤道取向。此外，H-12与δH 2.32 (H-18)存在相关。δH 0.86 (H-23)和δH 1.92 (Hβ-1)也与δH 1.34 (H-3)相关，从而将H-3、H-11和H-12的构型确定为β。
由于未能获得单晶，C-13位羟基的手性中心构型尚不明确。为此，采用计算NMR方法，计算了化合物7两种可能相对构型（13α-OH和13β-OH）下所有原子的理论化学位移。随后应用DP4+概率分析，获得了每种候选构型的概率得分，最终确定13-OH为β构型。
因此，化合物7的结构被确认为11α,12α-环氧-13β-羟基-3α-乙酰氧基-齐墩果-28-酸，命名为odoriferol G。
图5. 化合物7的关键HMBC（H→C）、¹H-¹H COSY（─）与¹H-¹H NOESY（↔）相关
基于已知的黄檀属植物生源合成途径，提出了化合物1和2的合理生源合成假设（图6）。
化合物1和2的骨架被认为来源于一条C₆-C₃-3×C₂聚酮链。该链通过聚酮合酶催化，将三个乙酸单元（C₂）与一个来自莽草酸途径的C₆-C₃单元（源自L-苯丙氨酸或L-酪氨酸）缩合而成。
该聚酮前体经过一系列电子转移与重排反应，在植物体内生成两种关键中间体A-1和B-1（均为已从降香黄檀中分离得到的已知化合物）。
中间体A-1（一个苯并呋喃化合物）经氧化水合转化为酮醇中间体A-2，随后环氧化得到A-3。中间体A-3通过环氧开环与分子内环化的协同级联反应，最终生成具有螺环骨架的化合物1。
另一方面，化合物2则可能源自中间体B-1（一个主要的新黄酮类化合物）。B-1经甲基阴离子对α,β-不饱和内酯的1,4-亲核加成得到中间体B-2。B-2互变异构形成烯醇B-3，随后氧化为羧酸中间体B-4。B-4的羧酸羰基经Tebbe烯烃化反应转化为末端烯烃B-5。碱处理促进B-5发生分子内共轭加成，环化形成内酯B-6。最后，B-6中的氧负离子发生甲基化，得到化合物2。
采用一氧化氮（NO）检测试剂盒，评估了所有分离化合物对脂多糖（LPS）诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7模型的抗炎活性。
结果显示，化合物1–7均显示出不同程度的NO抑制效应，其半数抑制浓度（IC₅₀）值介于6.3至46.1 μM之间（表4）。其中，化合物1a、2a、2b、4a、4b、6和7表现出显著的抑制活性，IC₅₀值在6.3至19.9 μM范围内。
值得注意的是，三萜类化合物7的抑制活性最强，IC₅₀值低至6.3 μM。
本研究从传统药用植物降香黄檀（Dalbergia odorifera）的心材中，系统分离并鉴定了12个新化合物，包括五对对映异构的黄酮及苯并呋喃类衍生物（(±)-odoriferols A–E, 1–5）、一个苯并呋喃（odoriferol F, 6）及一个三萜（odoriferol G, 7）。
综合运用现代波谱技术（UV、IR、HR-ESI-MS、1D/2D NMR）、计算机辅助结构解析（ACD/Structure Elucidator）以及计算化学方法（NMR/ECD计算），成功阐明了这些化合物的平面结构、相对及绝对构型。
其中，化合物1具有独特的螺[4.4]骨架，化合物2含有罕见的6/5/5三环系统，结构新颖。本研究还基于生源假设，合理推导了化合物1和2的形成途径。
体外抗炎活性筛选表明，七个化合物（1a、2a、2b、4a、4b、6和7）对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO产生具有显著抑制活性（IC₅₀ = 6.3–19.9 μM），尤其是三萜化合物7活性最为突出。
这些新化合物的发现，不仅丰富了降香黄檀的化学成分库，揭示了其化学多样性，也为基于天然产物的抗炎药物先导化合物发现提供了新的候选分子，对该药用植物资源的进一步开发利用具有科学意义。