案例摘要：本研究建立了一条面向微生物天然产物提取物的标准化去重复（dereplication）工作流：以 AntiMarin 数据库为源，构建收录 5,555 个化合物的结构数据库 StrepDB（含结构与预测 LC 保留时间），并基于 Spectrus DB 平台构建收录 665 种天然产物波谱数据的谱图数据库 MbcDB；通过 IntelliXtract 组分化、数据库检索与 ChromGenius 预测保留时间的联合筛选，对突变型白色链霉菌（Streptomyces albus ΔlgnC）提取物进行靶向去重复，成功发现两个新化合物 legonmaleimides A 和 B，其结构经波谱解析与计算机辅助结构解析（CASE）确证。该方法将研究资源集中导向可能产生新结构的提取物，显著提高了微生物天然产物研究的效率。
在天然产物药物发现中，化学去重复（chemical dereplication）是关键环节——尽早识别提取物中的已知化合物及其类似物，才能把分离与结构鉴定资源集中于可能产生新化合物的对象。目前常用 LC-DAD-MS 联用采集数据，其中高分辨电喷雾质谱（HRESIMS）灵敏度与多功能性突出，但仅凭质谱数据仍难以完全确定分子结构，最终仍需 NMR 提供完整结构信息。
现有去重复策略分为非靶向与靶向两类：非靶向方法缺乏特异性，容易重复分离已知化合物；靶向方法则能聚焦于新化合物或特定活性成分的定向发现。此外，现有 MS/MS 谱库仅覆盖约 10% 的已知天然产物，而面对已鉴定的 25 万余种天然产物，逐一实测保留时间并不现实——基于定量结构-保留关系（QSRR）的预测保留时间因此成为 HRMS 的重要辅助筛选维度。
本研究的目标是建立链霉菌天然产物的快速鉴定体系：构建含结构与预测保留时间的专属数据库 StrepDB；构建含实验波谱数据的谱图数据库 MbcDB；并通过突变型链霉菌提取物的实际分析验证该策略发现新化合物的能力。
StrepDB 基于 AntiMarin 数据库（2011 版，15,831 个独特分子量、35,850 个分子结构）构建，其中链霉菌属来源约 6,845 个结构。这些结构经 ChemSketch 导入并用结构检查功能排查异常，去除重复结构后得到 5,098 个 MOL 文件（占原始结构的 74.5%），再经 MS Workbook Suite 的 IntelliXtract 模块生成数据库。最终 StrepDB 收录 5,555 个化合物（5,098 个链霉菌来源 + 457 个其他来源），每个化合物均包含结构、精确分子量、分子式和预测 LC 保留时间。
研究以两个已知化合物（jasplakinolide 与 antibiotic A-23187）的 HRMS 数据优化预处理设置，将质量误差控制在 5 ppm 目标范围内。为评估保留时间窗口的作用，对链霉菌 MA3723 粗提物分别以「不设保留时间窗口」与「七个不同保留时间窗口（0–4.0 分钟）」进行筛选：保留时间窗口大小与排除的假阳性数量呈负相关（R²=0.97），仅 1.5 分钟窗口即可排除约 90% 仅基于 HRMS 产生的假阳性——凸显了预测保留时间作为附加筛选条件的价值。
方法准确性验证：从 StrepDB 中临时移除已知成分 legonmycin A 后，其对应质荷比 253.155 不再被注释；重新导入后系统即正确识别。该化合物实验保留时间与预测值相差 2.6 分钟，完全落在 4.0 分钟保留时间窗口之内，证实了预测保留时间作为筛选参数的可靠性。
MbcDB 收录 665 种海洋与陆地来源天然产物的结构信息与实验波谱数据，包括肽类（30 个）、生物碱（120 个）、萜类（300 个）及其他（215 个）；其中 502 个购自商业化标准品库，163 个来自实验室化合物库。数据类型涵盖 HRESIMS、LRMS/MS、¹H NMR 与 UV，部分化合物还包含 ¹³C NMR 与 2D NMR（COSY、HSQC、HMBC）。所有谱图以原始文件格式存储，可按需重新处理；数据库支持按名称、分子式、精确质量、结构与子结构检索，未知化合物的各类谱图可与库内谱图进行相似性比对。
保留时间预测采用 ChromGenius 完成。软件基于 log P、log D、分子量、分子体积、摩尔折射率、极性表面积及氢键受体/供体数等理化参数，以 417 个已实测保留时间的 MbcDB 标准品建立预测模型，并通过 Dice 系数相似性搜索选取知识库中 10% 最相似的化合物参与预测。实验与预测保留时间的总体相关系数 R²=0.75；76% 标准品的偏差在 0–2.0 分钟之间，93% 在 0–4.0 分钟之间。该模型最终用于预测 StrepDB 中全部 5,555 个化合物的保留时间。
应用 StrepDB 对加纳大学土壤分离的白色链霉菌（S. albus ΔlgnC）粗提物进行去重复分析。样品经改良 Kupchan 法分为四个极性组分，基于组分干重与离子强度优选水-丁醇组分进行 LC-MS 分析。采用 4.0（±2.0）分钟保留时间窗口筛选后，在 200–500 Da 范围内鉴定出 71 个质荷比，其中 4 个匹配 StrepDB 中 10 种已知化合物，其余 67 个（94%）可能为新化合物。
进一步通过手动添加 UV 谱图过滤器筛选与 legonindolizidines 相关的化合物，锁定 11 个目标质荷比：确认已知化合物 legonindolizidine A 与 B 后，从剩余 9 个未知质荷比中分离获得两个新化合物 legonmaleimides，其余 7 个因 HPLC 纯化得率过低未能完成结构鉴定。
水-丁醇组分经 C18 反相高效液相色谱分离纯化，获得两个新化合物 legonmaleimide A (1) 和 B (2)，以及已知化合物 legonindolizidines A (3) 和 B (4)。
化合物 1：HRESIMS 确定分子式 C14H21O5N2（不饱和度 6）。通过 MbcDB 的 ¹H NMR 谱图比对发现其质子信号与已知 legonindolizidines 相似；综合 ¹H NMR、HSQC 与 HMBC 数据，解析出四个亚甲基、一个次甲基、两个 sp² 杂化碳、三个酰胺基和一个羧酸基团，提示分子中含环状结构。结合 COSY 片段（H5-H6-H7 与 H10-H11-H12/H13）与 HMBC 相关，并比对昆虫病原真菌来源 maleimide 类化合物的 NMR 数据，最终确立 maleimide 核心与丁酸基团经 C5-N 键相连、3-甲基丁酰胺单元连接于 maleimide C2 位的结构。
化合物 2：HRESIMS 确定分子式 C14H23O5N2（不饱和度 5），与 1 的主要区别在于 C2-C3 双键的氢化。ROESY 实验观察到 H2 与 H3 间的强相关信号，证实其为顺式相对构型（绝对构型尚未确定）。
CASE 补充证据：将 1D/2D NMR 数据（HSQC、COSY、ROESY、HMBC）与分子式输入 Structure Elucidator Suite，采用模糊结构生成（FSG）模式计算所有可能结构。化合物 1 产生 77 个候选结构，化合物 2 产生 92 个；以实验与计算 ¹³C 化学位移差异（HOSE 算法 dA、增量法 dI、人工神经网络算法 dN）排序，三种算法的偏差均较低，且两个化合物所提出的结构均位列第一，为结构确证提供了补充证据。
从生物合成角度看，化合物 1 可能来源于中间体 legonindolizidine A (3)：经 C5 位羟基化与环重排生成活性醛中间体，再氧化为羧酸 1，最终还原生成化合物 2（图 10）。化合物 1 在人黑色素瘤细胞系 A2058 测试中无活性（250 μM 浓度下细胞存活率 100%）。
凯美科提示：本案例中，MS Workbook Suite（含 IntelliXtract 自动组分化）承担 LC-MS 数据的组分化与数据库匹配，Spectrus DB 承担结构库与谱图库的构建管理，ChromGenius 提供保留时间预测筛选，Structure Elucidator Suite 以 CASE 方法完成结构确证——多软件协同可应对微生物天然产物去重复与新化合物发现中的典型难题。如您所在团队有质谱定性或天然产物鉴定相关的分析需求，欢迎与我们联系，了解软件产品方案与技术合作。
