利用 logD 图辅助进行液相方法开发的案例

整理自凯美科公众号色谱方法开发药物分析

对药物分析研究员来说，液相方法开发的工作压力最大——开发前无法预判所需时间；千辛万苦开发出的方法，还可能在验证、转移、稳定性检测时出现问题需要再开发。此前的 HPLC 方法通常使用试错法或一次一个因子（OFAT）进行开发：影响分离的参数有 7–8 个，每个依次小步微调，显著增加实验次数，且很少考虑参数之间的相互作用。我们需要改变方法开发的方式——根据分子结构和理论知识指导开发，从 logD 图进行分析指导方法开发策略。

01　药典方法流动相中离子对试剂该加还是不加？

案例（1）：MFB 项目

研究发现各国药典的 MFB 有关物质检测方法流动相中均添加了离子对试剂庚烷磺酸钠：

但根据 MFB 结构进行分析，其应有一定的疏水性，可能不需要离子对试剂。对其结构及考察杂质做 logD 图，发现各 pH 条件下组分的 logD 均大于 0，即普通的 C18 柱即可保留。考虑到工艺优化中需要 MFB 的中控方法检测，若采用药典的离子对试剂方法，平衡时间和冲柱时间会比较久，离子对试剂还会对色谱柱造成不可逆损伤。故中控方法开发时去掉了离子对试剂，采用 pH 7.0 磷酸盐缓冲液和乙腈做流动相——开发出的方法中各组分均有保留和分离。

案例（2）：MNT 项目

MNT 各国药典均有收载，方法流动相中均添加了离子对试剂庚烷磺酸钠。通过预测 MNT 及其杂质的 logD 图，对结构进行分析，发现其有一定的疏水性，故在中控方法开发中去掉离子对试剂进行开发——最终方法下各组分均有一定的保留，且专属性符合要求。

02　KPA 项目流动相 pH 如何选择？

KPA 及其起始物料、中间体的 logD 图解析：

• pH 2–8 范围内 logD 均大于 1，有疏水性，普通 C18 即可保留
• 大部分组分没有酸碱基团，pH 变化 logD 不变呈直线——无酸碱基团组分的流动相可以无缓冲，直接选择水
• 各 logD 线基本分离无重合，组分分离难度不大
• pH 大于 8 时三个组分的 logD 随 pH 变大而降低，方法重现性可能较差——为保证耐受性，流动相 pH 选择 2–8 范围内
• 各中间体的中控方法均可在同一流动相体系下调整梯度程序进行开发

根据 logD 提供的信息设计方法开发策略：在 2 个起始物料、5 个中间体、1 个成品共 8 个方法开发过程中，实验人员基本没有遇到问题；整个开发过程没有盲目试错，根据理论知识指导开发，优化措施更有针对性，结果经常如预料，极大提高了工作效率。

03　复方制剂采用单一方法进行检测：NDE 和 TFA

NDE 药典收载方法的流动相为酸性流动相添加离子对试剂；TFA 参考标准流动相采用 pH 6.8 磷酸盐缓冲液和乙腈。根据 logD 作图，发现各组分 logD 线在 pH 6–8 范围内基本不变，且 logD 值大于 1，有一定疏水性——故选择普通 C18 柱在流动相 pH 6.8 处调整梯度程序，采用单一方法检测 NDE 和 TFA 及其杂质。

04　总结

logD 代表在不同 pH 条件下，化合物在正辛醇和水溶液中的分配系数比值的对数值，能够真实反映目标化合物在不同 pH 条件下的疏水性。疏水性是化合物在色谱柱上分离的重要影响因素：

• 根据 logD 图判断是否仅用疏水性即可达到保留和分离目的，还是需要引入其他作用力（离子对、氢键等）进行保留或分离
• 对于酸碱性物质，根据 logD 图选择方法中的流动相 pH
• 结合方法参数、logD 图及检测图谱分析方法的保留机制，判断影响方法的关键参数，指导方法开发

logD 图可以很好地将化合物的结构与保留联系起来，帮助根据化合物结构进行方法开发，提高方法开发能力，缩短方法开发时间。