案例摘要：新型芬太尼类似物作为新精神活性物质出现并在世界范围内造成大量死亡案例。瑞典研究团队对乙酰芬太尼、丙烯芬太尼、4-氟异丁酰芬太尼和呋喃芬太尼四种类似物开展了体外（混合人肝细胞，10 µM 孵育 5 小时）与体内（尸检真实尿液样本，每例 4–5 份）代谢产物鉴定研究，采用 UHPLC-HRMS 数据依赖采集模式，并用两种方式分析数据：(1) 基于预测生物转化的人工分析；(2) 基于 MetaSense 软件的数据驱动搜索算法智能分析。研究阐明了各类似物的代谢途径差异，并提出可用于尿液筛查的特征代谢物标志物。
近年来，新型芬太尼类似物不断作为新精神活性物质（NPS）出现，并在世界范围内造成许多死亡案例。对这类化合物的司法鉴定而言，摄入的证据通常只能在尿液等生物样本中寻找其代谢产物——原药在体内往往很快被清除。因此，确定这些新类似物是否遵循芬太尼及已知类似物相同的代谢途径、并找到稳定且丰富的特征代谢物，是建立尿液筛查方法的前提。
本研究选取了四种具有代表性的芬太尼类似物：乙酰芬太尼（acetylfentanyl）、丙烯芬太尼（acrylfentanyl）、4-氟异丁酰芬太尼（4-fluoro-isobutyrylfentanyl）与呋喃芬太尼（furanylfentanyl），分别开展体外与体内两条线的代谢产物鉴定。
体外实验：四种化合物在 10 µM 浓度下与混合人肝细胞孵育达 5 小时，模拟体内代谢环境。
体内实验：对每个化合物分析 4–5 份来自尸检病例的真实人体尿液样本，包括经酶解与未经酶解处理的样品。
分析平台：液相色谱高分辨质谱（UHPLC-HRMS），采用数据依赖型采集模式（data-dependent acquisition, DDA）进行数据采集。
数据分析采用两种方式平行进行：(1) 基于预测的生物转化进行人工分析；(2) 基于 MetaSense 软件使用数据驱动的搜索算法进行智能分析。前者依赖分析者对代谢规律的先验判断，后者则由软件从高分辨质谱数据中自动搜索与母药相关的代谢物，两者互为印证。
乙酰芬太尼的主要代谢方式包括 N-脱烷基化（苯乙基部分脱去）、乙基连接链和哌啶环上的单羟基化，以及苯环上的羟基化/甲氧基化，并观察到大量 II 相代谢结合产物（葡萄糖醛酸结合物与硫酸结合物）：
丙烯芬太尼呈现与乙酰芬太尼类似的代谢规律——N-脱烷基化、单羟基化与二羟基化并存，并检出多种葡萄糖醛酸结合物：
4-氟异丁酰芬太尼同样以 N-脱烷基化与羟基化为主要途径，此外还观察到酰胺水解产物与 N-氧化物等：
与前三种类似物不同，呋喃芬太尼的主要代谢物由酰胺水解和二氢二醇形成产生，而去甲基代谢物很少或根本没有在病例样品中检测到。这一差异提示：对新型芬太尼类似物不能简单套用已知类似物的代谢规律，逐一开展代谢鉴定研究十分必要：
总体而言，体外实验结果与体内实验结果吻合得很好，显示了两个系统中相同的生物转化；并观察到 II 相代谢结合产物的存在，特别是乙酰芬太尼。基于研究结果，作者建议将以下特定且丰富的代谢物作为尿液中的分析指标：
| 化合物 | 推荐尿液分析指标（特征代谢物） |
|---|---|
| 乙酰芬太尼 | 一种羟基甲氧基代谢物、一种单羟基化代谢物 |
| 丙烯芬太尼 | 一种羟基代谢物、一种二羟基代谢物 |
| 4-氟异丁酰芬太尼 | 两种单羟基代谢物、一种羟基甲氧基代谢物 |
| 呋喃芬太尼 | 二氢二醇代谢物、酰胺水解代谢物 |
面对高分辨质谱产生的大量数据，传统"预测生物转化 + 人工提取离子"的方式既依赖经验又容易遗漏未知途径。本研究中，MetaSense 以数据驱动的搜索算法从 DDA 采集的 UHPLC-HRMS 数据中自动检出与母药相关的代谢物（包括常见 I 相代谢与 II 相结合产物），与人工分析结果互为印证，显著提高了代谢物鉴定的覆盖度与效率。
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