高效手性筛选结合计算机建模快速开发手性方法
对映体的色谱拆分是学术界和工业界的公认难题，常见使用SFC色谱进行筛选分离。相较而言使用小粒径手性固定相在UHPLC平台上进行手性筛选和分离还处于发展阶段。因此MERCK在美国新泽西的MRL团队在本文介绍了一个他们的开发平台。这个平台的的筛选部分有14根色谱柱（包括2微米直径的全多孔色谱柱FPP以及3微米的表面多孔色谱柱）以及9种流动相供选择，包含反相，Hilic，Polar-Organic模式，Polar-ionic 模式等多种作用模式。筛选进行自动化操作所需人工干预少，拆分成功几率高。作者使用ACD/Labs AutoChrom软件的LC simulator对手性筛选的结果进行多因素建模优化，以缩短时间并提高耐用性。进行数学建模时，作者还发现温度因素需要用二项式进行模拟，而不是进行线性拟合，以此函数获得的模型预测更为精确。
背景和摘要
作者还举例将以上的工作策略应用于超快速的手性拆分以及2D-LC手性拆分研究，取得了很好的结果。国内有条件的企业可以考虑参考此平台的配置，构建自己的筛选和优化平台。
01 筛选平台介绍
仪器平台配置
Agilent UHPLC 1290 Infinity II, 配置有四元泵G7104A, 两套色谱柱控温G7116B, DAD 检测器 G7117B, 两套G1170A阀系统。
Agilent Chemstation C.01.07 SR3 软件。
筛选阶段使用的 14 根色谱柱：(S,S)-Whelk-O1（Regis Technologies，1.8 μm 全多孔硅胶，100 × 4.6 mm）、
ChiralPak IA-U / IB-U / IC-U / IG-U / ID-U（Chiral Technologies，1.6 μm 全多孔硅胶，100 × 3.0 mm），
以及 TeicoShell、VancoShell、NicoShell、TagShell、Q-Shell、CDShell、MaltoShell、LarihcShell（AZYP，2.7 μm 表面多孔硅胶，100 × 3.0 mm）；
除 Whelk-O1 为梯度、等度两用外，ChiralPak 系列同样支持梯度与等度，其余为等度模式。
流速0.5ml/min, 柱温35度，采集214，254，280nm 紫外信号，梯度和等度的总体运行时长都为10min。
02 筛选研究对象介绍
作者选择了共18种小分子化合物作为样本进行筛选研究，结构如下：
18种被筛选的化合物，每个化合物筛选14个方法，花费6个小时。
03 筛选结果
18种化合物的手性分离的筛选打分结果，绿色代表分离度大于1.5，红色代表分离度小于0.5，黄色代表分离度在0.5-1.5之间。带星号者被认为是最佳的方法。显然某些方法对多个手性化合物的分离都有效。某些色谱柱的对某个化合物的分离可以跨越流动相的种类。
此方法对色谱柱和流动相的所有可能组合进行全面评估，尤其是对于具有挑战性的对映体分离。此外，UHPLC筛选平台可以让色谱条件的趋势可视化，从而快速识别有效分离对映体所需的最佳分析条件，同时也为快节奏对映体纯度分析的精简发展奠定了基础。
从以上的结果来看有部分方法可以在60秒以内超快速的完成，部分方法在180秒内快速完成，只有个别的分子时间在3-10分钟内完成。用时较长的方法可以在后期优化过程中使用较短的色谱柱或者更高的流速进行时间缩短以实现超快速。
04 分离方法的建模优化以获得耐用性强的手性 UHPLC 分离方法
使用色谱模拟软件ACD/Labs AutoChrom里的LC-Simulator 模块2021.1.2版本，来自Advanced Chemistry Development （Toronto, Ontario, Canada）进行建模优化。
进行手性异构体分离优化时要注意的温度模拟函数
色谱柱：ChiralPak OD-3R (50 X 4.6毫米)
流速:0.5 mL/min
流动相A: 0.1%甲酸溶液；
流动相B: 乙腈
检测波长:UV 260 nm。
样品:每1.0 μL甲醇溶液中含有2.8 mg/mL 6-OH,15.8 mg/mL 7-OH和6.3 mg/mL
柱温及有机相等度比例两因素
- 柱温：10、20和40°C；
- 等度洗脱：30、40、50 % B
- 通过ACD/Labs AutoChrom软件模拟生成分离度图
通过ACD/Labs软件模拟生成分辨率图可得到最佳条件可选择为：柱温：20℃，等度条件：40%
当应用传统上对非手性小分子进行保留系数与1/T之间的一级多项式拟合，实验和模拟保留时间之间的差异较大 (ΔtR > 9%)。考虑分析不与CSP之间的额外作用点，进行保留系数与1/T之间的二阶多项式拟合，手性分离模拟和实验之间具有极好的拟合 (ΔtR < 0.1%)。因此进行有机相比例和温度两因素DoE时，实验设计应为三乘三。
对化合物8和化合物12进行优化
色谱柱：TeicoShell (50 × 4.6 mm I.D. 2.7μm superficially porous silica particles.
- 流动相A: 20 mM AmF, pH 4.0
- 流动相B：MeOH.
- 检测波长：220nm
- 等度洗脱：5−45% B
- 柱温条件：25, 35, and 45 ℃
使用AutoChrom 进行2因素建模获得分离度图。
ACD/Labs软件模拟可得到分离化合物8和化合物12及其对映异构体的最佳色谱条件：温度：10℃。梯度：25%B（0 min）、50%B（15 min）和25%B（15.1−18 min）；并且可得该色谱条件的耐用性范围-橙色区域，并且实验和模拟之间ΔtR < 0.5%，拟合度良好。
05 进行非手性与手性 2D-LC 筛选和建模
近年来2D-LC在进行超快速手性分离的应用发展的很快。数学建模辅助进行可视化的2D-LC分离已经在工业界崭露头角。以下例子是用多心切割非手性-手性2D-LC方法分离华法林和羟化代谢物。
UHPLC 筛选一维RPLC色谱条件，进行非手性分离的最优化，ACD/Labs软件做梯度斜率和柱温两因素三水平的实验设计以及色谱模拟可得到第一维最佳色谱条件。
流动相：A：0.1%磷酸溶液，B：乙腈
色谱柱：Ascentis Express C18 (100 × 4.6 mm I.D.,2.7 μm)
柱温：36℃，
梯度变化：35 %B (0−1 min), 55 %B (4min), 80 % B (4.4−5.2 min).
使用ACD/Labs软件做梯度斜率和柱温两因素三水平的实验设计以及色谱模拟可得到第二维最佳色谱条件。
流动相：A：0.1%磷酸溶液，B：乙腈
色谱柱：VancoShell (50× 4.6 mm I.D., 2.7 μm).
柱温：40 ℃
梯度变化：10−40 %B (0−5 min).
结论
手性液相色谱方法发展的瓶颈是筛选最佳的手性固定相和流动相组合，繁琐且费时。在此介绍的一种自动化的对映选择性UHPLC筛选工作流程，能大大减少了所花费的时间。引入新策略平台后确保在效率方面有实质性的改进，这样可以更好地协助实验室进行工艺合成的快速变化和优化。此外，使用软件建模来获得耐用的手性LC方法，能够从提高筛选过程的总体结果的质量。相比传统的手性高效液相色谱方法，该UHPLC筛选方法可以转化为更高效的高通量手性分析。